条石鲷促性腺激素基因的克隆、表达和性类固醇激素分析

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本文以人工培育的条石鲷(Oplegnathus fasciatus)为研究对象,运用组织学、同源性克隆和RACE克隆法、放射免疫测定(RIA)法等技术手段,对条石鲷卵巢各发育期特征、促性腺激素(GonadotropinHormone, GtH)和膜孕激素受体(membrane progestin receptor,mPRα)cDNA全长的克隆、在组织表达特性和卵巢发育不同时期的表达特性、血清中促性腺激素在繁殖周期中的变化规律等进行了研究,为深入认识条石鲷生殖调控机制提供了理论支撑。本研究结果为全面揭示条石鲷生殖调控机制以及繁殖调控研究提供了丰富的基础资料。相关结果如下:1.条石鲷促性腺激素α(GtHα)亚基的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,从条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)垂体中获得了全长为897bp的GtHα cDNA序列,其中包含249bp的5’非编码区、399bp的开放阅读框和249bp的3’非编码区。其ORF编码132个氨基酸,前38个氨基酸为信号肽。肽链中包括10个保守Cys残基和2个N-糖基化位点,在第122和124Cys中间间隔了一个组氨酸(His),形成CXC型趋化因子的特征结构。此外,在3’端末端含有一个加尾信号ATTAAA。其预测蛋白分子量为14.59KDa,预测等电点为8.41。氨基酸同源性和进化分析表明,条石鲷GtHα与鲈形目鱼类的进化关系较近,与鲈鱼的同源性最高为98%。实时荧光定量PCR方法检测发现,GtHα mRNA在脑、垂体、卵巢中的表达量较高,在心、肝脏、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微量表达,在脾脏、头肾、鳃、肾脏中不表达,其中在垂体中的表达量最高;周期表达表明,垂体中GtHα mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值,卵巢中GtHα mRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值,而脑组织中GtHαmRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。2.条石鲷促滤泡激素β(FSHβ)亚基的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和RACE方法从条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)垂体中获得了全长为554bp的FSHβ cDNA序列。其中开放阅读框长363bp,编码了含120个氨基酸的蛋白,其中前18个氨基酸为信号肽。肽链中含了12个保守的Cys残基和一个N-糖基化位点(NIS),在第255和第257半胱氨酸中间间隔了一个谷氨酸,形成CXC型趋化因子的特征结构。此外,在3’端含有一个加尾信号AAATAA。其预测蛋白分子量为12.96KDa,预测等电点为6.05。氨基酸同源性和进化分析表明,条石鲷FSHβ与鲈形目鱼类的进化关系较近,与花鲈的同源性最高为88%。实时荧光定量PCR方法检测发现,FSHβ mRNA在垂体、卵巢中的表达量较高,在脑、心、肝脏、脾脏、鳃、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微量表达,在头肾和肾脏中不表达,其中在垂体中的表达量最高;周期表达表明,垂体中FSHβ mRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值,而卵巢和脑组织中FSHβ mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。3.条石鲷促黄体激素β(LHβ)亚基的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和RACE方法克隆了条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)LHβ cDNA序列,并分析了LHβ mRNA在雌性条石鲷组织中的表达差异和卵巢发育不同时期卵巢、垂体、脑中表达水平变化。结果表明,条石鲷LHβ基因全长857bp,其中ORF为450bp,编码了149个氨基酸,前24个氨基酸为信号肽,肽链中包含了12个保守的Cys残基和一个N-糖基化位点(NQT),在第4个Cys和第5个半Cys位点之间存在着硬骨鱼类特异性的Cys-Ser-Gly-His(CSGH)区域。此外,在3’端含有一个加尾信号AATAAA。其预测的蛋白分子量为16.56KDa,理论等电点为5.52。氨基酸同源性和进化分析表明,条石鲷LHβ与鲈形目鱼类的进化关系较近,与斜带石斑鱼的同源性最高为98%。实时荧光定量PCR方法检测发现,LHβ mRNA在垂体和卵巢中的表达量较高,在鳃、心脏、脾脏、肾脏、肝脏、脑、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微量表达,在头肾中不表达,其中在垂体中的表达量最高;周期表达表明,垂体和卵巢中LHβ mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值,而脑组织中LHβ mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。4.条石鲷膜孕激素受体(mPRα)的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和RACE方法,从条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)卵巢中获得全长为1222bp的mPRα序列。其中开放阅读框为1060bp,编码了含353个氨基酸的蛋白。前16个氨基酸为信号肽。成熟肽部分包含了13个保守的Cys残基。其蛋白分子量为40.68KDa,理论等电点为7.08。氨基酸序列比较分析发现其结构中存在7个跨膜区域。系统进化分析表明,条石鲷mPRα与云纹犬牙石首鱼的同源性最高为98%。实时荧光定量PCR方法检测发现mPRα mRNA在脑和卵巢中的表达量较高,肾脏、鳃、心脏、脾脏、、幽门盲囊、肾脏、肝脏、脑、胃、肠、肌肉中表达量较低,其中在脑中的表达量最高。周期表达表明,垂体和脑中的mPRα mRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值,而卵巢中的mPRα mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值。5.血清中促性腺激素在条石鲷卵巢发育不同时期的含量测定利用125I标记的放射免疫测定(RIA)方法检测了FSH和LH在条石鲷在卵巢发育不同时期血清中的含量变化。结果表明: FSH在在卵黄生成期时急剧上升,并达到最大值,在产卵期时其含量有所下降。LH在卵黄生成期时急剧上升,在卵黄成熟期达到最大值,表明血清中FSH和LH的浓度与卵巢发育密切相关。实验结果还表明,血清中FSH和LH表达水平与FSHβ和LHβ mRNA呈现趋势一致的规律性变化。
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