海洋琼胶降解菌的分离、琼胶酶研究及三株新菌的鉴定

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海洋是生命的起源地,其中蕴含着丰富的资源,积极开发海洋资源,大力发展蓝色经济,是推动强国战略的重要方面。海洋生物中含有大量可利用的海洋多糖,琼胶是其中重要的组成成分之一,具有广阔的开发应用前景。琼胶降解菌可产生琼胶酶,为实现琼胶多糖的绿色、高效的生物降解提供了有力的工具,受到了广泛关注。本文以琼胶降解菌为主要研究对象,进行一系列研究工作。首先,以分离琼胶降解细菌为出发点,采集威海及日照沿海样品进行海洋微生物的筛选分离,共得到14株潜在新物种和7株琼胶降解菌。对其中的2株海洋新物种O448T和F02T及1株新型琼胶降解菌RQJ05T进行多相分类。经鉴定,菌株0448T呈革兰氏染色阴性、好氧性、无运动性,氧化酶和过氧化氢酶呈阳性,主要的呼吸醌是Q-10,主要的脂肪酸成为是C18:1ω7c,极性脂组成主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油,结合生理生化特征及遗传学特征分析,菌株0448T确定为红杆菌科中的新属新种,命名为沉积物大洋杆菌(Oceanibium sediminis gen.nov.,sp.nov.);菌株F02T细胞呈革兰氏阴性、严格需氧菌,具有运动性和氧化酶与过氧化氢酶活性,主要的呼吸醌是Q-8,主要的脂肪酸成分是C18:11ω7c、C16:1ω7c、C15:o和C18:1ω9c,主要的极性脂组成有磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和一种未被鉴定的磷脂,结合生理生化特征及遗传学特征分析,确定为--变形菌纲中的新属新种,命名为沉积物海栖杆菌(Maribactrumsediminisgen.nov.,sp.nov.);菌株RQJ05T革兰氏染色阴性、好氧型细菌,有运动性,氧化酶呈阳性但过氧化氢酶呈阴性,主要的呼吸醌是Q-8,主要的脂肪酸成分是Summed Feature 3(C16:1ω71 and/or C16:1ω6c)、C16:0 和 Summed Feature 8(C18:1 ω7c and/or C18:1ω6c),极性脂种类主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂,结合生理生化特征及遗传学特征分析,确定为交替单胞菌科中的新属新种,命名为嗜琼胶藻生菌(Algilactibacter agarilytica gen.nov.sp.nov.)。对琼胶降解菌QM202T和RQJ05.T进行基因组测序,对琼胶酶基因进行预测分析,共预测出28条潜在琼胶酶基因,其中菌株QM202T中有4条,RQJ05T中有24条。对预测得到的所有琼胶酶基因进行外源表达,对表达产物进行酶活检测,结果显示共有11个琼胶酶具有琼胶降解活性,其中菌株QM202T中有4个,RQJ05T中有7个。然后用亲和层析的方式成功纯化出重组琼胶酶QM202-1与RQJ05-21。最后对纯化后的重组琼胶酶的结构与酶学性质进行探究,结果显示,琼胶酶QM202-1属于GH50家族,最适反应温度为30-40℃,最适反应pH为7.0,DTT能大幅度增加酶活,降解产物为新琼四糖,比酶活为34.7U/mg。琼胶酶RQJ05-21属于GH16家族,最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0,Co2+、Fe2+、DTT能大幅度增加酶活,具有琼胶降解能力的同时也有一定程度降解淀粉、卡拉胶、海藻酸钠的能力,降解琼胶时比酶活为66.5 U/mg且产物为新琼四糖与新琼六糖。本研究分离并得到多株琼胶降解菌与多条琼胶酶蛋白,为实现琼胶多糖的绿色、高效的生物降解提供了有力的工具。
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