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目的接触蛋白-1(Contactin-1,CNTN-1)在多种肿瘤中表达上调并促进肿瘤细胞的侵袭及转移。之前,本课题组研究证实相比较于胃癌癌旁正常黏膜组织,CNTN-1在胃癌原发灶中表达上调,但其在胃癌侵袭及转移中的作用及其相应机制尚未阐明。因此,本研究主要探讨CNTN-1在胃癌侵袭及转移中的作用及其机制。材料与方法(1)应用免疫组化技术检测CNTN-1及EMT相关标志物(Snail、Slug、E-cadherin及N-cadherin)在人胃癌组织及其相应癌旁正常黏膜组织中的表达,分析其与胃癌患者临床病理特征及预后的关系,用Kaplan-Meier和Cox回归分析法进行生存分析。(2)应用聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测CNTN-1及EMT相关标志物在胃癌细胞KATO-III、SGC7901和MKN45中的表达;应用Transwell小室侵袭试验检测胃癌细胞KATO-III、SGC7901和MKN45的侵袭能力。(3)设计三条特异性靶向CNTN-1基因的shRNA,构建CNTN-1-shRNA慢病毒载体并转染胃癌细胞株MKN45。实验分为四组:对照干扰组(con sh)、干扰组1(sh#1)、干扰组2(sh#2)、干扰组3(sh#3);应用Western blot和细胞免疫荧光技术分析四组中CNTN-1蛋白表达情况。筛选CNTN-1干扰效率最佳的胃癌细胞系MKN45 sh#2用于后续的试验研究。(4)应用Western blot检测CNTN-1及EMT相关标志物在胃癌细胞MKN45亲本组(parental)、MKN45对照干扰组(con sh)和MKN45干扰组2(sh#2)中的表达;应用Transwell小室侵袭试验检测parental组、con sh组和sh#2组细胞的侵袭能力;应用Transwell小室迁移试验和细胞划痕试验分析parental组、con sh组和sh#2组细胞的迁移能力;应用细胞增殖试验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测parental组、con sh组和sh#2组细胞的增殖能力。(5)将等量的胃癌MKN45 con sh组和sh#2组细胞进行裸鼠皮下成瘤试验,比较con sh和sh#2两组细胞之间的增殖能力的差异,并应用Western blot检测CNTN-1及E-cadherin在con sh组和sh#2组皮下移植瘤中的表达;将等量的胃癌MKN45 con sh组和sh#2组细胞通过尾静脉注射入裸鼠体内,建立裸鼠肺转移模型;通过Micro-PET/CT技术、计量裸鼠肺转移结节数目和裸鼠肺转移HE染色方法比较con sh和sh#2两组细胞之间的侵袭及转移能力的差异;应用免疫组化检测CNTN-1及E-cadherin在con sh组和sh#2组裸鼠肺转移结节中的表达水平。结果(1)与癌旁正常黏膜组织比较,CNTN-1、Snail、Slug和N-cadherin在胃癌组织中的表达明显增高(59.7%vs 30.6%,P<0.001;52.8%vs 25.0%,P=0.001;54.2%vs 36.1%,P=0.029;52.8%vs 31.9%,P=0.011);相反,E-cadherin在胃癌组织中表达降低(43.1%vs 72.2%,P<0.001)。胃癌组织中CNTN-1、E-cadherin、Slug和N-cadherin的表达与胃癌患者的肿瘤浸润深度(P=0.001,P=0.022,P=0.005,P=0.010)、淋巴结转移(P<0.001,P<0.001,P=0.006,P=0.038)和TNM分期有关(P=0.002,P=0.011,P=0.002,P=0.019);胃癌组织中Snail的表达与胃癌患者的肿瘤浸润深度(P=0.036)和TNM分期有关(P=0.005),与淋巴结转移无关(P=0.260)。胃癌组织中CNTN-1、E-cadherin、Snial、Slug和N-cadherin的表达与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、Lauren分型、血管浸润和淋巴管浸润均无关(均P>0.05)。Spearman等级相关分析显示胃癌组织中CNTN-1的表达与Slug(r=0.324,P=0.005)和N-cadherin(r=0.244,P=0.039)的表达呈正相关,与E-cadherin(r=-0.430,P<0.001)的表达呈负相关,与Snail(r=0.131,P=0.274)的表达无相关性。Kaplan-Meier生存分析显示,胃癌组织中CNTN-1(P<0.001)、Slug(P<0.001)和N-cadherin(P=0.012)阳性表达组患者的5年生存率显著低于其阴性表达组患者;胃癌组织中E-cadherin阳性表达组患者的5年生存率显著高于其阴性表达组患者(P=0.001);胃癌组织中Snail阳性表达组患者的5年生存率与其阴性表达组患者的5年生存率无显著性差异(P=0.178)。Logistic回归分析提示胃癌组织中CNTN-1阳性表达是淋巴结转移的独立危险因素(P<0.001)。Cox风险回归多因素生存分析显示胃癌组织中CNTN-1(P=0.001)和Slug(P=0.002)阳性表达是影响胃癌患者术后生存的独立预后因素。(2)Transwell小室侵袭试验结果显示:胃癌细胞MKN45和SGC7901穿透小室的细胞数量显著多于KATO-III(P<0.05)。RT-PCR和Western blot试验结果表明:与胃癌细胞KATO-III比较,胃癌细胞MKN45和SGC7901中CNTN-1、Slug及N-cadherin mRNA和蛋白表达均上调,E-cadherin mRNA和蛋白表达下调;Snail mRNA和蛋白在上述三株细胞中表达无明显差异。(3)Western blot和细胞免疫荧光试验结果表明:构建的三个重组表达载体均可有效干扰胃癌细胞MKN45中CNTN-1蛋白的表达,其中sh#2组干扰效率最佳。(4)Western blot结果显示:与parental组及con sh组比较,sh#2组中Slug和N-cadherin蛋白表达均下调(P<0.001,P<0.001),而E-cadherin蛋白表达上调(P<0.001),Snail蛋白表达无明显差异(P>0.05)。Transwell小室侵袭试验及迁移试验结果均显示:与parental组及con sh组比较,sh#2组穿透细胞数均显著减少(P<0.001)。细胞划痕试验结果表明:与parental组及con sh组比较,sh#2组细胞迁移速率显著降低(P<0.001)。CCK-8试验结果显示:与parental组及con sh组比较,sh#2组细胞的增殖能力无明显差异(P>0.05)。(5)裸鼠皮下成瘤试验结果显示:sh#2组裸鼠皮下移植瘤的重量和体积与con sh组无明显差异(P>0.05)。Western blot结果显示:与con sh组比较,sh#2组裸鼠皮下移植瘤中CNTN-1蛋白的表达降低,而E-cadherin蛋白的表达增高。Micro-PET/CT显示两组裸鼠肺组织均呈模糊杂影,提示裸鼠远处肺转移模型成功建立。肺转移结节HE染色结果提示结节来源于尾静脉注射的胃癌细胞。此外,肺转移结节免疫组化结果显示:与con sh组比较,sh#2组裸鼠肺转移结节中CNTN-1蛋白的表达降低,E-cadherin蛋白的表达增高。裸鼠肺转移结节计数结果证实:sh#2组裸鼠肺转移结节数目显著小于con sh组(P<0.001)。结论(1)在胃癌原发灶中,CNTN-1高表达时,Slug及N-cadherin亦呈高表达,而E-cadherin呈低表达,并与胃癌的侵袭及转移相关,致胃癌患者预后不佳。(2)在胃癌细胞系中,CNTN-1高表达时,Slug及N-cadherin亦呈高表达,而E-cadherin呈低表达。此时,胃癌细胞的侵袭能力亦增强。(3)构建的三个重组表达载体均可有效干扰胃癌细胞MKN45中CNTN-1蛋白的表达,其中CNTN-1-shRNA2干扰效率最佳,为后续研究打下基础。(4)CNTN-1通过促进Slug表达,上调N-cadherin表达,抑制E-cadherin表达,从而促进胃癌细胞MKN45的迁移及侵袭能力。CNTN-1表达下调对MKN45细胞增殖能力无明显影响。(5)裸鼠体内研究证实:CNTN-1表达下调可抑制胃癌细胞MKN45的侵袭及转移能力,但对其增值能力无明显影响。CNTN-1可能是一个重要的分子靶点,干扰其表达可能抑制胃癌的侵袭及转移。