论文部分内容阅读
目的检测黑色素瘤抗原A3（Melanoma antigen A3, MAGE-A3）在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达情况，为MAGE-A3抗原对HCC患者进行特异性免疫治疗及判断预后提供理论依据。构建小鼠pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体，提取质粒DNA免疫小鼠，观察接种小鼠肝癌细胞株H22的成瘤情况，探讨MAGE-A3基因疫苗对HCC的免疫保护作用。方法1.收集福建医科大学附属第一医院HCC新鲜标本56例，提取HCC及相应癌旁肝组织mRNA，应用逆转录―聚合酶链反应(RT-PCR)检测MAGE-A3基因的表达；应用组织芯片和免疫组织化学技术观察HCC组织及相应癌旁组织中MAGE-A3蛋白的表达，分析MAGE-A3阳性表达与HCC患者临床病理特征之间的关系。2.化学合成小鼠MAGE-A3全长基因，限制性内切酶EcoR I/Xho I酶切小鼠MAGE-A3基因和真核表达载体pcDNA3.1（+）质粒，T4DNA ligase连接酶切片段，转化至感受态细胞，挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定。3.培养人肾上皮细胞株293T，重组pcDNA3.1(+)-MAGE-A3载体转染293T细胞，western-blot检测MAGE-A3蛋白的表达。4.培养小鼠肝癌细胞H22，5-Aza-Cdr诱导H22细胞表达MAGE-A3基因；抽提质粒DNA，大腿肌肉注射法免疫小鼠，每间隔7d免疫一次，第三次免疫后第七天，小鼠腋窝皮下注射MAGE-A3阳性的H22细胞，每日观察小鼠成瘤情况，ELISA法检测小鼠血清MAGE-A3抗体。结果1. RT-PCR检测HCC组织中MAGE-A3mRNA的阳性表达率为64.29%（36/56），癌旁肝组织和远癌肝组织均不表达MAGE-A3基因(0/58)，二者间差异具有显著性(P<0.01)；免疫组化技术检测HCC组织中MAGE-A3蛋白阳性表达率为53.9%（76/141），染色位于胞质，多为弥漫阳性，而相应癌旁组织均不表达MAGE-A3蛋白，二者间差异具有显著性(P<0.01)。2.成功构建pcDNA3.1(+)-MAGE-A3真核表达载体。双酶切鉴定获得大小约为1kb的片段，与MAGE-A3大小相符；经测序鉴定显示，测序结果与目标序列完全一致（Gene Bank ID:17139）。3.将pcDNA3.1(+)-MAGE-A3真核表达载体转染293T细胞，western blot检测见阳性蛋白条带，蛋白大小为40KD，证明pcDNA3.1(+)-MAGE-A3载体能有效表达目的蛋白。4.含5-Aza-Cdr的培养基常规培养小鼠HCC H22细胞6天后，RT-PCR检测证实H22细胞表达MAGE-A3基因。5.真核表达载体免疫3次后，小鼠接种MAGE-A3基因阳性表达的H22细胞。空载体组和生理盐水组小鼠第9天可触及肿瘤结节，重组载体组第11天触及肿瘤结节；第15天处死小鼠，重组载体组肿块的体积和重量明显高于空载体组和生理盐水组（P<0.05）；ELISA检测小鼠血清中出现MAGE-A3抗体。结论1. MAGE-A3基因在HCC组织中有较高表达，MAGE-A3抗原表达与肿瘤大小、AFP、HBsAg、复发、肝硬化背景、包膜和肿瘤分化程度均无关，与镜下脉管癌栓呈正相关。2.成功构建pcDNA3.1(+)-MAGE-A3真核表达载体，能在体外能有效表达目的蛋白。3. pcDNA3.1(+)-MAGE-A3基因疫苗能抑制表达MAGE-A3基因的小鼠成瘤，对小鼠肝癌的形成具有免疫保护作用。