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肠道菌群对动物的健康至关重要,具有多种生理功能,一旦菌群失调就可能会导致疾病的发生。在这种情况下,大多都是使用抗生素来解决。但是,随着抗生素的大量使用和滥用,抗生素产生了很多的副作用,这问题引起了广泛的关注。乳酸菌素是由某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽或前体多肽,其具有无毒、无副作用、无残留、对环境无污染的特点,在畜禽生产中,可作为饲料添加剂替代抗生素。但由于野生乳酸菌分泌的乳酸菌素产量低和乳酸菌素分离纯化困难,给规模化生产乳酸菌素带来了极大的麻烦。因此,本试验采用基因工程技术,体外表达乳酸菌素,并通过体外抑菌试验初步验证乳酸菌素的抑菌作用,最后,通过饲养试验来探讨乳酸菌素plnK对肉鸡肠道微生物菌群和黏膜免疫功能的影响。具体内容如下:1.四个乳酸菌素的原核表达。方法:针对乳酸菌素plnE、plnF、plnJ和plnK编码框序列,设计四对特异性引物,进行PCR扩增,将这四个PCR扩增产物,分别与原核表达载体pET-32a(+)连接构建重组表达质粒,经PCR、双酶切及测序等进行鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达以及诱导条件优化,并进行Western blot鉴定,对重组表达蛋白进行Ni-NTA亲和层析法纯化。结果:PCR、双酶切及测序等进行鉴定结果表明,pET-32a(+)-plnE、pET-32a(+)-plnF、pET-32a(+)-plnJ和pET-32a(+)-plnK四个重组原核表达质粒均被构建成功。将其转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞内,SDS-PAGE分析结果显示,经过IPTG诱导表达的这四个重组蛋白大小分别为26.2ku、25.7ku、26.0ku和26.2ku,与预期的结果都一致。重组蛋白的诱导条件优化结果表明,pET-32a(+)-plnE蛋白的诱导表达条件为12h、37℃和1.0 mmoL/L;pET-32a(+)-plnF蛋白的诱导表达条件为12h、37℃和0.6mmoL/L;pET-32a(+)-plnJ 蛋白的诱导表达条件为 12h、37℃和 1.2 mmoL/L;pET-32a(+)-plnK蛋白的诱导表达条件为12h、37℃和0.4 mmoL/L。Western blot结果表明,重组的四个乳酸菌素都被正确表达。Ni-NTA亲和层析纯化结果表明,pET-3 2a(+)-plnE蛋白、pET-32a(+)-plnJ蛋白、pET-32a(+)-plnK蛋白这三个重组蛋白在280mM的咪唑浓度洗脱效率最高,而pET-32a(+)-plnF蛋白在200mM的咪唑浓度洗脱效率最高。2.乳酸菌素体外抑制试验。方法:以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌为指示菌,牛津杯法检测四个重组乳酸菌素不同浓度下的抑菌效果;分别添加1uL、10uL、50uL和100uL的0.50mg/mL重组乳酸菌素,筛选出最佳的抑菌浓度;最后比较分析了 plnE+plnF、plnJ+plnK、plnE、plnF、plnJ、plnK抑菌效果。结果:四个重组乳酸菌素在添加量为50uL(终浓度为2.5×10-2mg/mL)时抑菌效果最好;乳酸菌素plnE、乳酸菌素plnF单独和组合的抑菌效果一致,乳酸菌素plnJ、乳酸菌素plnK单独和组合的抑菌效果一致,都达到了良好的抑菌效果;从牛津杯抑菌试验结果可以知道,这四个乳酸菌素在蛋白浓度为2.5×10-2mg/mL时,可以看到明显的抑菌圈。表明四个重组乳酸菌素具有广谱抗菌活性。3.乳酸菌素plnK对黄羽肉鸡肠道菌群和黏膜免疫的影响。方法:选取300羽4日龄健康黄羽肉公鸡,分成5个组,每组设置5个重复,每个重复12羽。Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为乙酸对照组,Ⅲ组为 5.00×10-3mg/mL 乳酸菌素 plnK 组,Ⅳ组为 2.50×1 0-3mg/mL 乳酸菌素plnK组,V组为1.25×10-3mg/mL乳酸菌素plnK组。试验期为28d,分别于饲喂后1周、2周、4周称重,记录采食量,计算料重比。采集各处理组肉鸡十二指肠,ELISA法测定各处理组SIgA含量;荧光定量PCR法检测各处理组肉鸡十二指肠黏膜免疫细胞因子(MDA5、IFN-α、IFN-β、TLR3、IFITM10、IFITM3 基因)的表达量;最后应用高通量测序分析各处理组肉鸡盲肠内容物菌群。结果:饲喂1周,Ⅳ组的平均日增重、平均日采食量、十二指肠黏膜SIgA含量显著高于 Ⅰ组(P<0.05),Ⅳ组的 MDA5、IFN-α、IFN-β、TLR3、IFITM10、IFITM3基因的表达量极显著高于Ⅰ组(P<0.01);高通量测序结果表明,饲喂1周,Ⅲ组出现特有的菌科:双歧杆菌科,且Ⅳ组、V组瘤胃球菌属UCG-013的丰度显著高于Ⅰ组(P<0.05);Ⅲ组、Ⅳ组、V组乳杆菌属丰度高于Ⅰ组(P>0.05);饲喂2周,Ⅳ组出现特有的菌科:酸杆菌科,Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组放线菌门的丰度小于Ⅰ组,V组粪球菌属的丰度显著高于Ⅰ组(P<0.05),Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组乳杆菌属的丰度高于Ⅰ组(P>0.05);饲喂4周,Ⅳ组、V组乳杆菌属的丰度高于Ⅰ组(P>0.05)。综上所述,本试验成功构建了 pET-32a(+)-plnE、pET-32a(+)-plnF、pET-32a(+)-plnJ和pET-32a(+)-plnK重组质粒,并成功在体外表达,获得了四个重组乳酸菌素,四个重组乳酸菌素均具有广谱抗菌活性;饲喂2.50×10-3mg/mL乳酸菌素plnK 2周提高了肉鸡十二指肠黏膜SIgA的含量,刺激免疫细胞因子的表达;提高了肉鸡肠道内酸杆菌门、软壁菌门、芽孢菌科、乳杆菌属等的丰度,从而促进肉鸡的生长。