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白藜芦醇甙(Polydatin)即3, 4’,5-三羟基芪-3-β-葡萄糖苷(3, 4’, 5-trihydroxystibene-3-β-mono- D-glucoside),为二苯乙烯类化合物,具有较强的生物活性。Polydatin是蓼科蓼属草本植物虎杖等的主要活性成分,在植物中分布广,含量较高,目前至少在70余种植物中发现了Polydatin。实验结果表明,Polydatin可抑制血小板聚集,降低白细胞对血管内皮的粘附性,改善休克微循环,抑制脂质过氧化,减轻氧自由基损伤,对缺糖缺氧及氯丙嗪损伤的心肌细胞有保护作用。在大鼠脑缺血/再灌注模型, Polydatin可不同程度地降低脑组织的过氧化物脂质含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性、降低脑含水量,减轻自由基反应对脑组织的损害,对缺血脑组织有保护作用,并呈明显的剂量依赖性。此外,有研究显示Polydatin对家兔肠、肺、肝和肾损伤均有保护作用,其保护作用与减少肿瘤坏死因子和溶酶体酶的释放有关。然而,有关Polydatin对心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤的影响,未见报道。本研究旨在通过生理学、药理学、免疫组化、流式细胞和分子生物学等方法探讨Polydatin的心脏保护作用及其作用机制。研究分为四部分:(1)Polydatin对大鼠缺血/再灌注心脏的保护作用:利用Langendorff离体心脏灌注系统,建立离体大鼠心脏缺血/再灌注模型,观察Polydatin对大鼠心脏缺血/再灌注损伤的影响,并探讨NO在其中所起的作用。(2)ATP敏感性钾通道和线粒体通透转换孔在Polydatin心脏保护中的作用:在大鼠离体灌流心脏,通过药理学方法探讨ATP敏感性钾通道(KATP)和线粒体通透转换孔(MPTP)在Polydatin心脏保护中的作用。(3)Polydatin对大鼠心肌细胞凋亡的影响:利用DNA琼脂糖凝胶电泳、TUNEL染色和流式细胞学等方法,观察Polydatin对大鼠心脏缺血/再灌注诱导的细胞凋亡的影响。(4)Polydatin的抗缺血/再灌注心律失常作用:采用在体大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型观察Polydatin对在体心脏缺血/再灌注心律失常的影响,并探讨其电生理学基础。I白藜芦醇甙对大鼠缺血/再灌注心脏的保护作用目的:探讨Polydatin对大鼠离体缺血/再灌注心脏的保护作用及其NO作用机制。方法:雄性SD大鼠随机分为两组:对照组和Polydatin组。利用Langendorff灌注技术,使心脏缺血30分钟再灌注60分钟,建立大鼠离体心脏全心缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤模型,观察Polydatin对缺血/再灌注后心脏收缩功能、心肌超微结构、心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量,一氧化氮(NO)含量以及一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。结果:(1) Polydatin组大鼠缺血/再灌注后的心脏左室发展压(LVDP)、左室压力上升和下降最大变化速率(±LVdp/dtmax)的恢复百分比分别为43.3±8.7 %, 42.9±14.9 %和42.4±21.3 %,明显高于对照组的22.5±11.2 %, 23.1±17.3 %和24.1±8.5 % (P<0.05～0.01)。(2) Polydatin能明显减轻缺血/再灌注后心肌超微结构的损伤。(3) Polydatin组大鼠缺血/再灌注后心肌SOD活性为965±77 U/g protein,明显高于对照组的788±137 U/g protein,而MDA含量则由对照的2.79±0.37μmol/g protein降低为2.15±0.50μmol/g protein (P<0.05)。(4) Polydatin组大鼠心肌缺血/再灌注后NO含量为3.58±1.47μmol/g protein,明显高于对照组的2.08±0.71μmol/g protein (P<0.05)。Polydatin组大鼠NOS及cNOS活性分别为1.23±0.34 KU/g protein和0.76±0.35 KU/g protein,明显高于对照组的0.85±0.16 KU/g protein和0.38±0.19 KU/g protein (P<0.05)。(5) NO合酶抑制剂L-NAME能够拮抗Polydatin对缺血/再灌注心脏的保护作用。小结:Polydatin具有明显的抗心肌缺血/再灌注损伤作用,此作用主要由cNOS产生的NO增加所介导。ⅡATP敏感性钾通道和线粒体通透转换孔在白藜芦醇甙心脏保护中的作用目的:探讨ATP敏感性钾通道(KATP)和线粒体通透性转换孔(MPTP)在Polydatin心脏保护中的作用。方法:雄性SD大鼠随机分为七组:对照组、Polydatin 25μmol/L组、Polydatin 50μmol/L组、Polydatin 75μmol/L组、格列本脲(Glibenclamide)组、5-羟基癸酸(5-hydroxydecanoate, 5-HD)组、苍术苷(Atractyloside)组。利用Langendorff灌注技术,在离体大鼠心脏观察不同药物对缺血/再灌注后心功能和心肌梗死面积的影响。结果:(1)与对照组相比,Polydatin (25、50、75μmol/L)可浓度依赖地改善大鼠缺血/再灌注心功能的恢复。再灌注60分钟后,Polydatin (50μmol/L)组心脏左室发展压(LVDP)、左室压力上升和下降最大变化速率(±LVdp/dtmax)和冠脉流量(CF)分别为(41.7±9.2) mmHg,(1069.9±77.0) mmHg/s,(-992.8±294.5) mmHg/s和(4.1±1.1) ml/min,明显高于对照组的(20.8±12.0) mmHg,(598.3±219.5) mmHg/s,(-506.9±180.5) mmHg/s和(2.4±0.4) ml/min (P<0.05或0.01);而左室舒张末压(LVEDP)为61.4±3.2 mmHg,明显低于对照组的76.2±6.0 mmHg (P<0.01)。(2)预先应用非特异性ATP敏感性钾通道(KATP)阻断剂格列本脲可完全消除Polydatin (50μmol/L)对缺血/再灌注心脏的保护作用;此外,特异性线粒体KATP阻断剂5-HD能够大部分阻断Polydatin (50μmol/L)心功能改善作用。(3)再灌注初期应用线粒体通透性转换孔(MPTP)开放剂atractyloside可完全消除Polydatin (50μmol/L)的保护作用。(4) Polydatin (50μmol/L)明显限制缺血/再灌注后心肌梗死面积,此作用可被格列本脲、5-HD和atractyloside所阻断。小结:Polydatin具有明显的抗心肌缺血/再灌注损伤作用;此作用与KATP,尤其是线粒体KATP开放以及抑制MPTP开放有关。Ⅲ白藜芦醇甙减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡目的:探讨Polydatin对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响及其相关机制。方法:雄性SD大鼠随机分为三组:对照组,缺血/再灌注(I/R)损伤组,Polydatin组。利用Langendorff灌注技术,使心脏缺血30分钟再灌注60分钟,建立离体大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)模型。观测缺血/再灌注后心肌细胞凋亡的变化。通过流式细胞技术,测定心肌Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:(1)琼脂糖凝胶电泳显示I/R损伤组心肌DNA呈云梯状改变,而在Polydatin组则无明显云梯状改变。(2)与I/R损伤组相比,Polydatin明显减少缺血/再灌注后心肌凋亡细胞(TUNEL染色) (18.1±4.0% vs 35.1±5.4%, P<0.01)。(3)流式细胞仪测定I/R损伤组及Polydatin组心肌凋亡率分别为15.43±4.55%和8.66±3.18%。(4)I/R损伤组心肌的Bax蛋白表达比Polydatin组的高(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比率在Polydatin组较I/R损伤照组的为高(P<0.05~0.01)。小结:Polydatin可减少缺血/再灌注诱导的大鼠心肌细胞凋亡,可能通过增加Bcl-2蛋白表达,减少Bax蛋白表达所实现。Ⅳ白藜芦醇甙的抗心律失常作用及其电生理学机制目的:探讨Polydatin的抗心律失常作用及其电生理学机制。方法:雄性SD大鼠随机分为两组:对照组,Polydatin组;利用冠脉结扎/放松方法,建立在体心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤模型,观察Polydatin对缺血/再灌注心律失常的影响。并应用经典玻璃微电极技术记录心室乳头肌动作电位。结果:(1)与对照组相比,Polydatin组大鼠缺血/再灌注心律失常明显减少,Polydatin大鼠缺血和再灌注心律失常评分分别为1.0±1.5和2.0±1.8,明显低于对照组大鼠的3.5±1.0和4.5±1.6 (P<0.05或0.01)。与对照组相比,Polydatin可显著减少缺血/再灌注后心肌梗死面积(P<0.01)。(2) Polydatin (25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)可剂量依赖性地缩短乳头肌细胞的动作电位复极化50%时间(APD50)和90%时间(APD90)。APD50由对照的22.2±3.1 ms缩短为19.1±2.0 ms、16.4±1.5 ms和13.6±1.6 ms;APD90由对照的114.9±11.2 ms缩短为108.6±15.5ms、88.1±15.7 ms和70.7±9.9 ms。(3)对部分去极化的乳头肌,Polydatin (50μmol/L)使APD90由72.8±14.4 ms缩短至49.7±8.2 ms,动作电位幅值(APA)由53.2±8.5 mV降至42.9±4.6 mV,超射值(OS)由2.3±5.0 mV降至-6.9±6.5 mV,0期最大上升速度(Vmax)由46.9±6.6 V/s降至27.4±9.7 V/s。(4)应用KATP通道阻断剂格列本脲(10μmol/L),可部分拮抗Polydatin (50μmol/L)的电生理效应;(5)预先应用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME (1 mmol/L),对Polydatin的上述效应无影响。小结:Polydatin具有明显的抗心肌缺血/再灌注心律失常作用;Polydatin部分通过KATP,浓度依赖性地缩短动作电位时程,并抑制部分去极化乳头肌动作电位,此作用可能是Polydatin抗心律失常的电生理学机制之一。结论1白藜芦醇甙具有明显的抗心肌缺血/再灌注损伤作用,此作用可由cNOS产生的NO增加所介导。2 KATP,尤其是线粒体KATP开放以及MPTP开放的抑制可能参与白藜芦醇甙的心脏保护作用。3白藜芦醇甙可减少缺血/再灌注诱导的大鼠心肌细胞凋亡,可能通过增加Bcl-2蛋白表达,减少Bax蛋白表达所实现。4白藜芦醇甙具有明显的抗心肌缺血/再灌注心律失常作用;白藜芦醇甙可缩短正常乳头肌细胞动作电位时程,抑制部分去极化乳头肌动作电位;可能与钙离子内流减少和开放KATP增加钾离子外流有关。