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目的:脑血管病是目前世界上影响人类健康,威胁生命的主要疾病之一。我国每年约有250万新增脑血管病患者。与欧美相比,我国脑血管病发病率和死亡率远高于心血管疾病。缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是指因脑部血液循环障碍,缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。缺血性卒中是脑血管病中的一大重要分类,约占我国脑血管病患者的80%,该病致残致死率高,耗费了大量的社会及医疗资源,同时给病患带来了极大的身心痛苦。目前血管再通是缺血性卒中的核心治疗手段。在有效时间窗内进行静脉溶栓或机械取栓治疗,可以挽救处于灌注临界状态的缺血半暗带区细胞,从而减轻患者神经功能障碍,降低致残致死率,提高生存率,最终改善患者的生活质量及预后。然而由于早期诊断条件和治疗时间窗的限制,目前能够接受血管再通治疗的患者仍为少数。此外,缺血/再灌注损伤的发生导致治疗效果并不理想。因此,在分子水平上探索一种的敏感且特异的有助于急性缺血性脑卒中早期诊断、治疗以及评估预后的指标是亟待解决的难题。缺血继发的神经细胞死亡是脑卒中致残致死的首要原因。脑缺血后氧糖消耗,维持细胞和组织正常结构和功能的能量供应减少,导致一系列副反应,如离子稳态失衡、氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)产生以及线粒体损伤。缺血缺氧损伤后,脑细胞可以出现肿胀、破裂和细胞裂解等坏死样表现或染色质凝聚和DNA断裂等凋亡样表现,这一过程中细胞坏死和凋亡可同时出现。灌注临界状态的缺血半暗带区脑组织处于电衰竭与能量衰竭之间状态,局部脑组织尚存大动脉残留或侧支循环血供,该区脑组织损伤是可逆的。若能在短时间内迅速恢复缺血半暗带区血供,神经细胞能够存活并且恢复功能。自噬是为了满足机体本身代谢需要和细胞器的更新,细胞质内蛋白或细胞器自身吞噬并包裹形成囊泡,随后与溶酶体结合降解代谢的过程。在生理和病理情况下均存在细胞自噬,在病理情况下自噬既可以发挥保护作用,亦可以发挥破坏作用,也因此常被认为是一柄“双刃剑”。KCNQ1OT1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1 opposite strand 1)位于11p15.5,是一个具有调节功能的非编码反义RNA,可作为一个印记基因簇调控表观基因沉默。KCNQ1OT1在糖尿病、肺癌、肾癌及胶质瘤等多种疾病中表达上调,并且与急性心肌梗死发生左心功能障碍发生存在密切关系。但KCNQ1OT1在急性缺血性脑卒中表达情况及发挥的生物学作用,目前国内外尚无相关报道。本研究初步探讨了KCNQ1OT1在缺血再灌注损伤后的表达变化,以及对缺血再灌注损伤诱导的自噬的潜在调节机制。方法:本研究收集了2016年10月至2017年7月于中国医科大学附属盛京医院神经内科行静脉溶栓的急性脑卒中患者42例以及我院同期的健康体检者40例的外周血标本,分离获得血浆。建立小鼠短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型和细胞氧糖剥夺复氧(oxygen and glucose deprivation reoxygenation,OGD/R)模型分别模拟体内及体外缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤条件。小鼠侧脑室注射慢病毒沉默脑组织中KCNQ1OT1表达。构建KCNQ1OT1表达沉默质粒稳定转染的小鼠神经母细胞瘤(Neuro2a,N2a)细胞株,miR-200a过表达或沉默质粒转染的N2a细胞株,FOXO3过表达或沉默质粒稳定转染的N2a细胞株,ATG7沉默质粒稳定转染的N2a细胞株。采用qRT-PCR法分别检测KCNQ1OT1、miR-200a、FOXO3及ATG7小鼠脑组织以及N2a细胞内的表达变化。Western blot检测小鼠脑组织和N2a细胞中,FOXO3、ATG7、LC3B II和SQSTM1的蛋白表达差异。免疫荧光观察细胞LC3B蛋白表达及分布变化。CCK-8法检测细胞活力改变。流式细胞仪和TUNEL染色法检测细胞凋亡情况。透射电镜下观察自噬体。感染腺病毒mRFPGFP-LC3B监测细胞内自噬流改变。双荧光素酶报告基因分析验证KCNQ1OT1与miR-200a之间,miR-200a与FOXO3之间的特异性结合位点。染色质免疫共沉淀实验证实FOXO3与ATG7启动子区的直接结合。结果:1、KCNQ1OT1在急性脑卒中患者外周血血浆以及tMCAO小鼠脑组织中高表达,并且与疾病严重程度呈正相关;miR-200a在tMCAO小鼠脑组织中低表达,与KCNQ1OT1表达水平负相关。抑制小鼠脑内KCNQ1OT1表达水平,能够抑制自噬,并且减轻I/R后脑组织损伤。2、OGD/R损伤后神经元自噬能够加剧细胞凋亡,从而降低细胞活力。3、沉默KCNQ1OT1可抑制OGD/R诱导的神经元自噬,增加细胞活力,促进神经元存活。miR-200a受KCNQ1OT1的直接调控,两者之间能够特异性结合。4、过表达miR-200a能抑制OGD/R诱导的神经元自噬,增加细胞活力,促进细胞存活;沉默miR-200a能促进OGD/R诱导的神经元自噬,降低细胞活力。5、FOXO3在tMCAO小鼠脑组织中高表达,并与miR-200a表达水平呈负相关。FOXO3促进OGD/R损伤诱导的神经元自噬。FOXO3过表达减低OGD/R处理后的细胞活力。6、FOXO3的3’UTR区存在miR-200a的特异性结合位点。KCNQ1OT1通过调节miR-200a的表达水平进而调控FOXO3的表达。7、ATG7在tMCAO小鼠脑组织中高表达。ATG7启动子区能够与FOXO3直接结合。ATG7参与了KCNQ1OT1/miR-200a/FOXO3轴对OGD/R诱导的自噬的调控过程。结论:1、KCNQ1OT1在I/R损伤的脑组织和神经元中高表达,沉默KCNQ1OT1能抑制I/R损伤诱导的自噬,促进神经元存活,减少脑组织损伤和神经功能障碍。2、miR-200a在I/R损伤的神经元中低表达,过表达miR-200a能抑制I/R损伤诱导的自噬,并促进神经元存活。3、FOXO3在I/R损伤的脑组织和神经元中高表达。FOXO3是miR-200a的靶基因,FOXO3能够靶向调控下游ATG7的表达和功能。4、沉默KCNQ1OT1通过促进miR-200a的表达,加强了miR-200a对FOXO3的负性调控作用,使FOXO3的表达水平降低,抑制了ATG7转录,抑制I/R损伤诱导的自噬,增加细胞活力,促进神经元存活。