肝癌是最为常见的恶性肿瘤之一,近年来肝癌发病率和死亡率还在呈逐年上升的趋势,而且全世界近一半的肝癌患者在中国,这已经给人类健康造成了严重的影响。随着临床放疗技术的愈发成熟,立体定向体部放射治疗(SBRT)已在肝癌治疗中得到了广泛的应用。目前肝癌放疗疗效的评估主要还是基于影像学资料,或者参考传统肿瘤标志物的变化水平,缺乏早期的、高灵敏度的预后标志物。多项研究已经证实多种分子类标志物在肝癌中异常表达,与肝癌的发生发展有着密切关系,具有肝癌放疗预后判定生物标志物的潜能。本研究通过高通量测序分析临床患者SBRT前后的血样中转录组学变化,筛选新型分子标志物及治疗靶点,并通过肝癌原位移植瘤模型进行靶向治疗验证,为临床放射诊疗提供科学依据。目的为临床SBRT治疗原发性肝癌寻找可靠的分子类预后肿瘤标志物,并观察靶向基因干预联合放射治疗对大鼠原位肝癌移植瘤的治疗效果,以期为SBRT临床疗效评估和寻找肝癌治疗新靶点提供科学依据。方法1.肿瘤标志物的筛选:选取某三甲医院符合纳入标准的原发性肝癌患者17例,采集病人临床血样(其中验证例数14例),时间点为肝癌患者SBRT治疗前、治疗后1(治疗后出院前)和治疗后2(治疗后2个月)血样,提取RNA。经转录组学高通量测序(mRNA),筛选出SBRT治疗前后表达差异显著的分子,筛选标准为q value(即校正后的p value)<0.05且|log2FC|>1。收集患者病历资料,出院后3个月影像学资料,复查肝脏病灶大小,判断肝癌患者转归情况(CR,PR,SD或PD),将CR与PR归为SBRT有效组,SD与PD归为SBRT无效组。结合荧光实时定量qPCR检测,将疗效分组与有显著差异的mRNA变化比例做关联性分析,观察SBRT后有变化的mRNA是否在有效组和无效组中有差异性。依据治疗后疗效和患者SBRT前后qPCR检测结果,绘制ROC曲线,根据灵敏度、特异度、约登指数和ROC曲线下面积AUC值评价不同分子作为肝癌SBRT预后生物标志物的能力。2.实验动物及分组:选用6周龄健康雄性Wistar品系大鼠60只,体重在201-225g之间。通过手术构建大鼠原位肝癌移植瘤模型,随机分为假照射组(Control)、单纯放疗组(IR)、空载病毒对照组(sh-NC)、空载病毒+放疗组(sh-NC+IR)、AdipoR1沉默组(sh-AdipoR1)和AdipoR1沉默+放疗组(sh-AdipoR1+IR),每组10只。3.动物模型的建立:(1)肝癌腹水的制备:复苏w256细胞,加入1.5mL PBS缓冲液吹打混匀制成悬液后。准备4-5周龄健康雄性Wistar大鼠,抽取1mL细胞悬液注射入大鼠腹腔(细胞数量约1×10~6个),约6-7天后穿刺抽出腹水,显微镜下细胞计数,制备成大鼠原位模型所需浓度(8×10~7个/mL)的悬液。(2)种植肿瘤:选用6周龄健康雄性Wistar大鼠,体重在201-225g之间。5%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠,左腹上部竖直切口约1-1.5cm暴露肝脏,将左肝叶挤压到切口附近,抽取1×10~7细胞悬液缓慢匀速注射进肝左叶中,关腹,逐层缝合皮肤。术后12小时内禁食,每天腹腔注射7万单位的青霉素,连续3天。待肿瘤直径达到15mm左右时直接实施治疗。4.基因靶向及放射治疗:(1)病毒液配置:将LV-AdipoR1-RNAi病毒液和阴性对照病毒液CON077冰浴溶解后,每支病毒按1∶3体积比加入HiTransG A病毒感染试剂混合均匀。(2)病毒液注射方式:暴露瘤体后,将病毒液多点注射进入瘤体,关腹逐层缝合,术后12小时内禁食。(3)放射治疗:将麻醉大鼠放置在X-Rad320升降板上,调整大鼠体位使暴露的原位瘤体处在升降板的中心点。准直器直径2cm,靶中心剂量为7Gy。设置照射计划:电压320kV,电流12.5mA,1号滤板(铝制),距离(SSD)50cm,剂量率195.0cGy/min,单次照射剂量为7Gy,连续照射3天。照射完毕后立即关腹缝合,12小时内禁食后正常食水饲养。5.评价指标:观察记录不同治疗方式后大鼠的行为学及整体情况,测量大鼠体重、测量肿瘤直径,判断治疗效果,通过实时荧光定量PCR法检测基因变化,通过计算脾脏和胸腺指数判断大鼠的免疫功能,以及通过测量血常规和肝功能指标从而判断基因及放射治疗大鼠的生理状态和对肿瘤的杀伤效果。结果1.肝癌肿瘤标志物的筛选:经转录组测序后分析分子表达量在放疗前后的改变,发现SBRT治疗后保持升高的基因有16个,保持下降的基因有12个。计算了在有效组和无效组中28个mRNA在两个不同阶段的变化比例,并计算出相应的Z值和P值,发现AdipoR1和EPB42两个mRNA有显著差异(p<0.05),两者均具有作为预后标志物的潜力。依据疗效分组和患者SBRT治疗前后的qPCR结果,绘制ROC曲线,AdipoR1和EPB42基因理论值灵敏度分别为100%和75%,约登指数分别为0.83和0.75,实际值灵敏度分别为60%和80%,提示两新型标志物AdipoR1和EPB42基因可用于评价肝癌SBRT预后情况。2.大鼠治疗后的整体表现:各组大鼠均未有腹水出现、癌细胞腹腔转移,各组大鼠进食及饮水情况正常,未见腹泻等肠型放射病症状出现。Control组、sh-NC组及sh-AdipoR1组大鼠在治疗结束7天后与经过放射治疗的三组大鼠相比产生了比较明显的差异:经过放射治疗的大鼠体重均未发生显著变化,精神状态良好,毛发光泽未改变,而Control、sh-NC和sh-AdipoR1三组大鼠的体重则出现了一定程度的下降,饮水、活动较少,部分有竖毛表现。治疗结束7天后,sh-NC组与sh-AdipoR1组相比,sh-NC组大鼠体重出现了一定程度的下降;IR组与sh-AdipoR1+IR组相比,IR组大鼠体重也出现了一定程度的下降(p<0.05)。3.多种处理因素对肿瘤生长的抑制作用:实时荧光定量PCR验证了AdipoR1基因的沉默效果,IR组和sh-NC+IR组中AdipoR1基因表达量增高较Control组升高,sh-AdipoR1组和sh-AdipoR1+IR组中AdipoR1的基因表达量较Control组显著降低(p<0.05)。经过放射治疗7天后的大鼠肿瘤体积与未经放射治疗(Control组、sh-NC组、sh-AdipoR1组)相比有比较明显的减小趋势,提示放疗有效抑制了肿瘤的生长和发展;sh-AdipoR1组与sh-NC组相比,治疗后肿瘤体积也有所减少(p<0.05),sh-AdipoR1+IR组的大鼠肿瘤体积也小于IR组。除了Control组和sh-NC组,其他组的大鼠在经过治疗后肿瘤体积均有不同程度的减小,sh-AdipoR1+IR治疗肿瘤直径减小最明显。4.多种处理因素对脾脏和胸腺指数的影响:IR组与Control组、sh-NC+IR组与sh-NC组、sh-AdipoR1+IR组与sh-AdipoR1组两两比较可以发现,大鼠的脾脏指数和胸腺指数均有比较明显的升高(p<0.05),sh-NC组的大鼠脾脏、胸腺指数与sh-AdipoR1组相比无统计学差异,IR组的大鼠脾脏、胸腺指数与sh-AdipoR1+IR组相比也无明显的变化。5.多种处理因素对血常规指标的影响:与Control组相比,IR组大鼠血液中的红细胞数、血红蛋白含量和血小板数显著提高(p<0.05);sh-NC组与Control组相比,各项数值变化无统计学差异;与sh-NC组相比,sh-NC+IR组白细胞数显著减少,其余3项指标皆显著增高;沉默AdipoR1时,红细胞数、血红蛋白含量和白细胞数提升得到了体现(p<0.05),这是白细胞数唯一升高的一组大鼠;当沉默AdipoR1同时联合放疗后,除红细胞数并未出现统计学差异、白细胞数减少之外,血红蛋白含量和血小板数均出现了好转的趋势。经过了放射治疗的大鼠红细胞数和血红蛋白含量增加,贫血得到了缓解,沉默AdipoR1基因也可以显著减少大鼠的贫血症状,同时增加机体内白细胞数提高免疫抵抗能力。两种治疗方式相结合的大鼠中血红蛋白含量最高,疗效比较显著;同时血小板生成增多也得益于IR或者是sh-AdipoR1+IR。6.多种处理因素对肝功能指标的影响:除sh-NC+IR组并未显示出统计学差异外,IR组、sh-AdipoR1组、sh-AdipoR1+IR组大鼠的ALT均有所下降,其中以sh-AdipoR1+IR组下降最多。虽然在AdipoR1沉默的大鼠中,加入放疗与否并未体现出统计学差异,但是其他的治疗方式都可以明显降低血清中AST的含量。sh-AdipoR1沉默组虽然较sh-NC组ALP数值有所下降,并未体现出统计学差异,但是IR组和sh-AdipoR1+IR组可以证明放疗或是沉默AdipoR1基因的疗法加入,一定程度降低了ALP,提高了肝功能。sh-AdipoR1+IR组的白蛋白达到了最高,其与sh-AdipoR1组效果相当。结论1.本研究筛选出两个肝癌新型肿瘤预后标志物(AdipoR1和EPB42),是可用于评价肝癌患者SBRT预后的、具有高敏感度和特异度的生物标志物。2.沉默AdipoR1基因的表达,可以改善肝癌模型大鼠的生存状态,对肿瘤有显著的抑制效果。3.与单纯放射治疗相比,沉默AdipoR1基因靶向联合放射治疗对于大鼠肝癌有更好的局控率,能显著改善大鼠的预后状况,其拥有更为显著的治疗效果。对AdipoR1的进一步研究或能给临床诊断和治疗原发性肝癌带来新的契机。