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背景:A型流感病毒Non-structrual protein 1 (NS1)能与宿主细胞内众多蛋白相互作用,表现为对宿主的免疫抑制作用,并影响信号转导和蛋白质合成。NS1蛋白含有约230个氨基酸片段,C-末端4个氨基酸被称为PDZ结合基序(PDZ binding motif)。突触后密度蛋白(Postsynaptic Density Proteins, PSD-95)主要存在于神经元细胞,含有3个PDZ结构区域(PDZ domain)。PSD-95作为神经元细胞鹰架蛋白,结合了众多功能蛋白。PSD-95在神经元细胞离子平衡,信号转导, N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)聚集等方面均发挥着重要作用。目的:为了研究A型流感病毒NS1与PSD-95蛋白之间存在的相互作用及不同亚型流感病毒NS1与PSD-95相互作用的差异;检测这两种蛋白结合作用对神经元细胞功能的影响。利用基因克隆技术,通过GST-pull down,酵母双杂交,免疫共沉淀,免疫荧光定位等技术来确定不同亚型流感病毒NS1蛋白与神经元突触后密度蛋白PSD-95之间的相互作用。通过测定nitric oxide (NO)含量变化来证实NS1与PSD-95相互结合后对神经元细胞功能的影响。方法:通过GST-pull down证实NS1与PSD-95在体外的相互结合;酵母双杂交及α-半乳糖苷酶活性测定,模拟NS1与PSD-95在体内的相互作用;免疫共沉淀,免疫荧光定位确定NS1与PSD-95在哺乳动物细胞内相互结合情况;通过Griess reagent检测亚硝酸盐,确定细胞内NO产物含量。结果:A/Shantou/169/2006 (ST169, H1N1)、A/Shantou/602/06 (ST602, H3N2)、A/Guangdong/1/2005 (GD05, H5N1)、A/Quail/HongKong/G1/97 (G1, H9N2)各亚型病毒中,仅H5N1亚型流感病毒的NS1 (NS51)能够与PSD-95相互作用;酵母双杂交,X-gal,α-半乳糖苷酶活性检测中,转染PGAD-NS51+PGBK-PSD-95的酵母菌AH109能在-ade/-leu/-trp/-his培养基(quadruple drop-out medium, QDO)平板上生长,X-gal强阳性,α-半乳糖苷酶活性单位为3.504±0.082 millunit/ml;转染PGAD-NS11+PGBK-PSD-95的AH109在QDO仅极少菌落生长,X-gal弱阳性,α-半乳糖苷酶活性单位为0.184±0.112 millunit/ml;(阳性对照:1.252±0.065 millunit/ml,阴性对照:0.061±0.023 millunit/ml);GST-pull down,免疫共沉淀试验中,仅NS51与PSD-95存在相互结合;NO产物检测,确定NS51与PSD-95相互作用后对神经元功能的影响,结果表明:使用慢病毒lentivirus-NS51感染大鼠海马神经元,NO产生被抑制;pcDNA-NS51,pcDNA-NS11分别转染人神经瘤细胞系SH-SY-5Y,NS51组NO产生被抑制,NS11组NO产生显著增加。结论:实验发现了H5N1亚型流感病毒NS1与神经元突触后密度蛋白PSD-95之间存在相互作用;而其它亚型NS11,NS32,NS92则不能与PSD-95结合;说明不同亚型流感病毒与PSD-95结合特性上存在差异;另外,NS1与神经元PSD-95相互结合能够抑制神经元NO的产生。材料与方法选取由本实验室提供的A型流感病毒A/Shantou/169/2006 (ST169, H1N1), A/Shantou/602/06 (ST602, H3N2), A/Guangdong/1/2005 (GD05, H5N1), A/Quail/HongKong/G1/97 (G1, H9N2),选用流感病毒分离鉴定细胞系Madin-Darby canine kidney (MDCK)细胞,通过空斑形成试验(Plaque-forming assay),得到流感病毒A/Shantou/169/2006 (ST169)、A/Shantou/602/06 (ST602)、A/Guangdong/1/2005 (GD05)、A/Quail/HongKong/G1/97 (G1)的空斑形成单位(Plaque forming unit, PFU)分别为1.2×10~7 PFU/ml、4.2×10~7 PFU/ml、1.1×10~6 PFU/ml、1.0×10~6 PFU/ml;MDCK细胞使用含10%FBS的DMEM进行培养,大鼠海马神经元细胞则使用含10% FBS, 1% B27的neurobasal培养基进行培养;构建相应载体: pGAD-NS11, pGAD-NS32, pGAD-NS51, pGAD-NS92, pGBK-PSD-95, flag-PSD-95, pcDNA-NS11, pcDNA-NS32, pcDNA-NS51, pcDNA-NS92, pcDNA-PSD-95,慢病毒Lentivirus-NS51 (NS11表示ST169的NS1,NS32表示ST602的NS1,NS51表示GD05的NS1,NS92表示G1的NS1)进行包括GST-pull down、酵母双杂交、免疫共沉淀(Co-IP)在内的试验以检测不同亚型流感病毒NS1与突触后密度蛋白PSD-95之间的相互作用;其它相关试剂包括:兔抗PSD-95抗体,小鼠抗NS1抗体,Protein G magnetic beads,HRP标记的二抗以及Cy3和Alexa488标记的羊抗兔,羊抗小鼠二抗;使用碧云天的总Nitric oxide (NO)检测试剂盒检测NS1与PSD-95相互结合后,对细胞内NO含量的影响。结果1.空斑形成试验测得ST169 (H1N1)、ST602 (H3N2)、GD05 (H5N1)、G1 (H9N2)的空斑形成单位PFU分别为:1.2×10~7 PFU/ml,4.2×10~7 PFU/ml,1.1×10~6 PFU/ml,1.0×10~6 PFU/ml;2.酵母双杂交试验表明,流感病毒NS51与PSD-95能够相互结合, NS11与PSD-95不存在或仅存在微弱的相互结合,NS32,NS92与PSD-95则不存在相互结合;X-gal试验表明,NS51,NS11与PSD-95能够相互作用,而NS32,NS92与PSD-95则不存在相互作用;α-半乳糖苷酶活性单位检测表明,NS51与PSD-95能够相互作用;3. GST-pull down结果显示:NS51与PSD-95能够相互结合,而NS11与PSD-95不存在相互结合;4. Co-IP结果显示:仅NS51与PSD-95存在相互结合;5.免疫荧光结果表明:神经元,SH-SY-5Y细胞中,NS51与PSD-95存在共定位;6. NO检测显示:慢病毒Lentivirus-NS51感染神经元细胞,NS51能够抑制NO产物的产生;SH-SY-5Y细胞中,NS51能够抑制NO产物的产生,而NS11则促进NO产物的产生;结论1.不同亚型流感病毒NS1与PSD-95存在不同的结合特性,NS51与PSD-95能够相互结合,而其它亚型流感病毒NS1 (NS11, NS32, NS92)与PSD-95不存在相互结合;2.流感病毒NS1与PSD-95蛋白的相互结合,能够抑制人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y,及神经元细胞中NO的产生和释放;