研究背景:心肌梗死及心力衰竭是威胁人类健康的重要疾病。虽然通过早期的再灌注治疗可以挽救大部分心肌细胞的死亡,但随之而来的心室重塑和心力衰竭仍然无法逆转,其根源在于有功能的心肌细胞数目的大量减少。最终实现心功能的修复和心衰的逆转需要用新的心肌组织替换坏死和纤维化的原有组织。传统的观点认为哺乳动物心脏作为终末分化器官,出生后心肌细胞的数目不再增加,因而成年心肌无再生功能。然而近十多年的研究已充分证明成年心肌细胞在生理和病理情况下均具有一定的自我更新功能,但其再生能力十分有限,自然条件下无法达到显著的修复效果。近年来利用谱系示踪技术发现,在出生后的小鼠中,心肌再生的主要来源是原有心肌细胞的增殖,而以c-kit+细胞为代表的“原位心脏干细胞”的分化作用可以忽略不计。同时,通过双荧光报告基因的谱系示踪技术也进一步提示,在出生后的小鼠中,非心肌细胞难以向心肌细胞转分化。这些研究确立了原有心肌细胞增殖在哺乳动物心肌再生中的重要地位。本研究团队应用谱系示踪结合活细胞实时追踪技术,不仅证实了内源性心肌细胞增殖是心肌再生的主要来源,并发现心肌细胞的去分化-增殖-再分化是成年小鼠心肌梗死后心肌再生的重要机制。成年心肌细胞的增殖潜能十分有限,远不能达到心肌损伤后自我再生的效果。因此,心肌细胞增殖的调控机制是心肌再生领域的关键科学问题,这对于寻找刺激成年哺乳动物心肌细胞增殖的靶点、实现对心肌梗死等疾病的再生治疗具有重要意义。哺乳动物的心脏在胚胎期和出生早期仍具有完全的再生能力,该能力在出生后迅速下降至极低水平,主要原因是由于出生后心肌细胞增殖能力的迅速下降。因为出生后1周内的小鼠心肌增殖能力较强,对出生后1天的小鼠进行心尖切除约15%心室肌,心肌组织可实现完全再生。该动物模型已被公认为新生小鼠的心肌损伤后再生模型。新近的研究发现心肌表观遗传调控是影响心肌细胞增殖关闭和重启的重要因素,从表观遗传入手,探明心肌细胞增殖的分子“开关”是寻找激活成年心肌细胞增殖、促进心梗后心肌修复的重要策略。长链非编码RNA作为新发现的非转录组基因和表观遗传分子,在心脏的发育和心肌疾病的进程中至关重要。本研究通过对心尖切除模型的高通量筛选揭示了lncRNA-DRR在生理和病理情况下对心肌细胞增殖的作用及其分子机制。Wnt信号通路是心脏胚胎发育中的关键分子,通过对人胚胎干细胞的系统性分析发现,Wnt/β-catenin可以促进胚胎干细胞向中胚层细胞分化,并且抑制中胚层细胞向心肌细胞的分化。在成年哺乳动物的心肌中,生理情况下心肌细胞中的Wnt信号处于抑制的状态,而缺血缺氧等病理条件下Wnt信号可被重新激活。近期研究表明抑制Wnt信号通路可能对小鼠心肌梗死具有治疗作用。然而Wnt信号通路对心肌细胞增殖的直接作用尚不清楚。Wnt信号通路的激活主要依靠分泌型Wnt蛋白与膜受体的结合,细胞内的Wnt蛋白首先要经过棕榈酰化才能被分泌到胞膜外,因此棕榈酰化为调控Wnt信号的有效靶点。CGX1321是新型Wnt蛋白棕榈酰化抑制剂,已经批准进行临床试验,具有安全性高、作用稳定等特点。本研究阐明了CGX1321对于心肌梗死后心肌增殖再生的影响及其分子机制。研究方法:第一部分:1.利用小鼠心尖切除模型进行mRNA和lnc RNA高通量分析,筛选调控心肌细胞增殖的候选lncRNA。2.分离和培养新生大鼠原代心肌细胞,使用候选lnc RNA的siRNA或过表达质粒干预。通过细胞核分裂(Ki67和p H3)以及胞质分裂(Aurkb)指标的免疫荧光染色,筛选和验证具有调控心肌细胞增殖功能的lncRNA。3.利用荧光原位杂交(FISH)、RNA编码潜能分析网站和qRT-PCR等技术和方法研究目标lncRNA物种保守性、编码潜能、组织细胞分布和亚细胞定位等基本特征。4.通过qRT-PCR技术检测目标lncRNA对心肌细胞成熟或幼稚基因的影响。第二部分:1.建立lnc RNA敲除转基因小鼠,通过qRT-PCR技术鉴定小鼠品系是否建立成功。2.通过细胞增殖等指标的免疫荧光染色,研究lncRNA对小鼠心脏发育和心肌细胞增殖的影响,并建立心尖切除模型,研究lncRNA对小鼠心肌细胞增殖和损伤后修复的影响。3.建立心肌梗死模型,通过细胞增殖等指标的免疫荧光染色、心脏超声、马松染色等方法,研究lnc RNA-DRR对小鼠心肌细胞增殖和心梗后修复的影响。第三部分:1.行野生型和lncRNA-DRR敲除小鼠心肌梗死后的高通量转录组学分析,明确lnc RNA-DRR调控的下游信号通路,通过心脏组织冰冻切片行免疫荧光染色量化心肌细胞中DNA损伤变化。2.利用生物信息学预测分析筛选与lncRNA-DRR直接相互作用的蛋白质分子。3.利用荧光能量共振转移进一步确定与lncRNA-DRR相互作用的信号分子,明确lnc RNA-DRR作用于心肌细胞增殖的分子机制。第四部分:1.在原代心肌细胞中验证CGX1321对心肌细胞Wnt-5a/b蛋白分泌的抑制作用。2.建立心肌梗死模型,通过心脏超声、TTC染色、马松染色和细胞增殖指标免疫荧光染色,研究CGX1321对小鼠心肌细胞增殖和心梗后修复的影响。3.提取原代心肌细胞并建立缺氧模型,收集CGX1321处理48小时后的心肌细胞总蛋白和核蛋白,经典Wnt信号通路以β-catenin的入核为标志,非经典Wnt信号通路以NFATc3的入核为标志,通过蛋白免疫印迹验证CGX1321对经典和非经典Wnt信号通路的影响。研究结果:第一部分:1.假手术和心尖切除后7天心肌细胞具有明显的增殖能力差异,筛选出的目标lnc RNA-DRR位于小鼠4号染色体上,属于反义长链非编码RNA,具有三个外显子、两个内含子,主要分布于心肌细胞核中,少量分布于细胞质。2.lncRNA-DRR表达的下调可以显著提高原代心肌细胞的核分裂和胞质分裂比例,相反lnc RNA-DRR表达的上调可以显著降低心肌细胞的核分裂和胞质分裂比例。3.lnc RNA-DRR下调后心肌细胞成熟相关基因MYOM2、COX6A2和GJA1显著下降,心肌细胞趋于幼稚化。第二部分:1.生理条件下lnc RNA-DRR敲除后,P7小鼠心脏解剖结构、心肌细胞增殖指标和WGA染色无显著变化。2.对lnc RNA-DRR敲除小鼠乳鼠建立心尖切除模型后,心肌细胞增殖指标显著上升,心肌细胞明显变小,术后7天和28天心肌组织瘢痕均明显变小,术后28天基本达到心肌组织的完全修复。3.对lnc RNA-DRR敲除成年小鼠建立心肌梗死模型后,术后24小时心肌损伤标志物cTnT无明显变化,术后28天左室射血分数和短轴缩短率显著上升,而左室舒张期内径和收缩期内径显著下降;lncRNA-DRR敲除组心肌梗死后纤维化水平显著下降,而心肌细胞核分裂(Ed U、Ki67和p H3)和胞质分裂(Aurkb)指标显著上升,心肌细胞大小无明显变化。第三部分:1.成年野生型和lncRNA-DRR敲除小鼠心肌梗死后两周的心脏组织样本高通量转录组学分析发现细胞周期和DNA损伤后修复信号通路发生显著变化。2.利用cat RAPID数据库预测lnc RNA-DRR与DNA损伤后修复相关蛋白SFPQ相结合,RNA免疫共沉淀证实了lncRNA-DRR与SFPQ蛋白在心肌细胞中存在直接结合。3.利用荧光能量共振转移发现在lncRNA-DRR敲除小鼠的心肌细胞中结合状态的SFPQ/NONO蛋白复合体显著增多,同时心肌细胞中DNA损伤指标γH2A和p-ATM的富集显著减少。第四部分:1.处理体外培养的心肌细胞48小时后,发现CGX1321组细胞中和上清培养基中的Wnt-5a/b均显著下降。2.心肌梗死模型中,CGX1321注射后可以显著提高心肌梗死的存活率,显著提高心肌梗死后左室射血分数、左室短轴缩短率以及左室后壁舒张期厚度。3.心肌梗死模型中,CGX1321可以显著减少心肌梗死术后28天的梗死面积,梗死边缘区和梗死区的纤维化程度,提高心肌梗死后增殖的心肌细胞数量。4.CGX1321处理心肌细胞48h后,蛋白免疫印迹发现在非缺氧条件下CGX1321对β-catenin和NFATc3的表达无显著影响,而在缺氧条件下,CGX1321可以显著抑制核蛋白中β-catenin和NFATc3的表达,而对总蛋白中的β-catenin和NFATc3无显著影响。结论:1.小鼠心尖切除模型可以作为筛选心肌细胞增殖相关lncRNA的动物模型,心尖切除模型中高通量分析筛选出的lncRNA-DRR对心肌细胞增殖和幼稚化具有负性调控作用。2.生理情况下,lncRNA-DRR对小鼠出生后早期发育阶段的心功能、心脏解剖结构、心肌细胞增殖和大小无显著影响;新生小鼠心尖切除后,lnc RNA-DRR敲除可以显著促进心肌细胞增殖,进而促进心肌再生;成年小鼠心肌梗死后,lnc RNA-DRR敲除可以显著促进成年小鼠心肌细胞增殖、抑制心肌纤维化,进而提高心脏功能。3.心肌梗死后,lncRNA-DRR敲除小鼠的心肌细胞中结合状态的SFPQ/NONO蛋白复合体显著增多,促进DNA损伤后修复,增加心肌细胞增殖能力。4.在体外培养心肌细胞中,小分子Wnt抑制剂CGX1321具有抑制心肌细胞Wnt-5a/b蛋白分泌的作用。成年小鼠心肌梗死模型中,CGX1321促进心肌细胞增殖、抑制纤维化,改善心功能。其机制为CGX1321抑制心肌细胞中Wnt-5a/b的产生和分泌,进而调控β-catenin和NFATc3蛋白入核介导的经典和非经典Wnt信号通路。