犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CD V)属于副粘病毒科麻疹病毒属,病毒粒子有囊膜,基因组为单股负链RNA,大小为15690nt。自基因组的3’端至5’端,依次为3’引导序列、结构蛋白(N、P、M、F、H、L)基因、5’尾随序列。CDV可感染肉食目大多数动物而致病,免疫接种是目前唯一有效防治该病的措施。不分节段单股负链RNA病毒(Nonsegmented negative-strand RNA viruses, NNSVs)由于其只在细胞质复制,避免与宿主基因组发生整合,安全性高；病毒各蛋白的模块式表达方式,方便外源基因的表达；病毒基因组包装容量大,可插入长达4-5kb的外源基因；外源基因于重组病毒中能稳定、高效的得到表达等诸多优点,常用作重组疫苗载体的研究。CDV作为NNSVs的一员,有极大的作为活病毒疫苗载体的潜力。本课题拟建立弱毒株CDV-L反向遗传学操作平台,并探究其用作活病毒疫苗载体的潜力。对本实验室保存的弱毒株CDV-L进行序列测定,在此基础之上,分6段对CDV-L全长进行扩增,最后利用In-Fusion无缝连接技术构建病毒基因组全长cDNA克隆载体,并于基因组3’端引入T7RNA聚合酶启动子,5’端引入丁肝核酶序列。构建核衣壳蛋白N、P、L基因的辅助表达载体。建立了一株稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系BHK-T7,将上述各质粒共转染该细胞系成功拯救了rCDV-L。将EGFP基因插入CDV-L基因组P、M之间的非编码区,拯救成功的重组病毒感染细胞内有绿色荧光蛋白的产生,证明rCDV-L可作为载体表达外源蛋白。进一步,分别将狂犬病毒(Rabies virus, RV) Flury-LEP株G蛋白和水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis virus, MEV) VP2蛋白基因插入病毒基因组,拯救重组病毒rCDV-RV-G和rCDV-MEV-VP2并探究rCDV-L作为活病毒疫苗载体的能力。实验结果证实,rCDV-RV-G感染细胞内G蛋白得以表达,且插入到重组病毒粒子的囊膜中。rCDV-RV-G免疫小鼠和狗,二者体内均能产生抗CDV和RV的中和抗体,证明rCDV-RV-G具有双价疫苗的潜质,rCDV-L具有活病毒疫苗载体的能力。重组病毒rCDV-MEV-VP2, VP2基因的插入虽然不影响病毒的拯救,但病毒感染的细胞内检测不到VP2的表达。将VP2-N端一段具有抗原表位的小肽段基因与G蛋白基因进行无缝连接,重组病毒rCDV-G-VN感染细胞内虽然有外源蛋白的表达,但将重组病毒rCDV-G-VN免疫小鼠,免疫小鼠血清中未能检测到MEV的中和抗体。具体原因有待进一步研究。本课题成功构建了CDV-L反向遗传学操作平台,并证实CDV-L具有一定的活病毒疫苗载体的潜质。