Toll样受体(TLRs)是模式识别受体(PRRs)中的一个家族,属于Ⅰ型跨膜受体,宿主通过模式识别受体识别病原相关分子模式(PAMPs)。这种识别可激活随后的信号通路,从而引发宿主的免疫应答。TLR5在宿主防御细菌病原中发挥重要作用,可识别细菌的鞭毛蛋白；TLR15是禽类特有的,在哺乳动物中无同源相似物,可识别沙门菌的某些成分。家禽制品的沙门菌污染是一种全球性的公共卫生威胁。近年来在我国,肠炎沙门菌(SE)被认为是引起食物中毒最主要的因素之一。深入理解宿主抗SE的天然免疫应答将会为降低家禽制品的病原污染提供更多的选择。我国鸡遗传资源非常丰富,拥有80多种不同品种鸡。这些资源可为我国乃至世界范围的养禽业提供有价值的育种材料。然而,迄今尚未有关于我国品种鸡抗SE的天然免疫应答方面的相关研究报道。本研究旨在克隆和比较我国不同品种鸡的TLR5和TLR15基因序列,并从天然免疫角度探讨不同的遗传品种鸡抗SE感染能力的差异,从而为进一步研究鸡TLRs功能以及家禽在抗沙门菌感染研究方面积累一些理论依据。1.我国不同地方品种鸡TLR5、TLR15和鹅TLR5基因的克隆及其序列分析根据GenBank上已发表的鸡TLR5和TLR15基因序列,设计特异性引物,以鸡基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因,并对测序结果进行比较分析。另外,利用Rapid amplification of cDNA ends (RACE)技术克隆出鹅TLR5基因,并将其与其它物种的TLR5基因序列进行同源比较。应用SMART程序对鸡TLR5、TLR15和鹅TLR5基因蛋白结构域预测分析,结果显示它们都属于Ⅰ型跨膜糖蛋白,具有典型的TLR结构特征,即由胞外富含亮氨酸重复区(leucine-rich repeats, LRRs)、跨膜区和胞内Toll/interleukin-1受体(TIR)结构域组成。鹅TLR5基因的开放阅读框(ORF)为2583bp,编码860个氨基酸,为单一外显子；其氨基酸序列与人、小鼠和鸡的TLR5氨基酸序列同源性分别为50.3%、49.9%和82.7%-82.8%. TLR5和TLR15基因在不同品种鸡之间存在较高的同源性,相对保守；不同品种鸡的TLR5基因核苷酸同源性在99.8%以上,氨基酸同源性在99.4%-99.9%之间；TLR15基因的核苷酸同源性在99.7%以上,氨基酸同源性在99.4%-99.9%之间。不同品种鸡的TLR5基因ORF内有9个不同的核苷酸位点,其中有4个属于非同义替换,主要分布在乌骨鸡和青壳鸡中；这4个位点都位于胞外区,其中1个位于LRR中(E341K),1个位于LRRCT中(A619E)。不同品种鸡的TLR15基因ORF内有16个不同的核苷酸位点,其中有7个属于非同义替换；这7个位点中有4个位于胞外区(E158K、A309E、L332F和K389R),但都不在LRR中；另外3个位点位于胞内区,其中1个位于TIR中(F710L),主要分布在安卡鸡中。这些变化位点可能会影响TLRs对相应配体的识别作用,从而影响机体对入侵病原的免疫应答。2.不同地方品种鸡抗肠炎沙门菌感染天然免疫应答研究采集我国4个不同地方品种鸡(青脚麻鸡、三黄鸡、乌骨鸡和雪山麻鸡)的全血,分离外周血淋巴细胞(PBMCs),体外感染肠炎沙门菌50041株,分别在感染后2和4h,应用实时荧光定量PCR检测相关TLRs (TLR4、TLR5和TLR15)和细胞因子(IL-β、IL-6、 TGF-β4、CXCLi2和CCLi2) mRNA的表达情况。结果显示,感染后乌骨鸡和雪山麻鸡的TLR4和TLR15mRNA表达量高于另外两个品种鸡,而TLR5在三黄鸡中表达量低于其它3个品种鸡；乌骨鸡和雪山麻鸡中IL-1β、IL-6、CXCLi2和CCLi2mRNA的表达量要高于青脚麻鸡和三黄鸡；感染后4h时,青脚麻鸡中TGFβ4mRNA的表达量要显著高于雪山麻鸡(p<0.05)。通过上述的体外感染实验结果,可以初步看出乌骨鸡和雪山麻鸡对肠炎沙门菌具有较高的抵抗力。鉴于此,本文接着研究了其中3个品种鸡(三黄鸡、乌骨鸡和雪山麻鸡)口服感染SE后,脾脏和盲肠扁桃体中相关TLRs和细胞因子mRNA的表达情况。SE口服感染后,三种TLRs (TLR4、TLR5和TLR15)在雪山麻鸡的脾脏和乌骨鸡的盲肠扁桃体中的表达量相对于其它品种鸡而言要高。乌骨鸡和/或雪山麻鸡的脾脏和盲肠扁桃体中IL-1β、IL-6和CCLi2mRNA在感染后呈较高水平地表达,且三黄鸡盲肠扁桃体中这些细胞因子的表达要低于未感染的鸡；此外,SE感染也引起雪山麻鸡脾脏和乌骨鸡盲肠扁桃体中的CXCLi2mRNA高量表达,表明乌骨鸡和/或雪山麻鸡在抗肠炎沙门菌感染的炎性细胞因子应答上呈现出一定的优势。通过体外感染和体内感染两部分实验表明乌骨鸡和/或雪山麻鸡在天然免疫应答方面对肠炎沙门菌感染具有较高的抵抗力。