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背景：肾癌确诊时30％-40％已有转移，5年生存率不足10％。其对化疗、放疗、免疫治疗均不敏感，因此迫切需要寻找新的治疗方法。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，它是将与靶基因同源的小片段双链RNA（small interfering RNAs，siRNA）转染靶细胞，从而特异性降解靶基因mRNA，RNAi有望成为肿瘤基因治疗的有力工具。但基因治疗方案至今没有取得实质上的突破，使得基因-病毒治疗应运而生。基因-病毒治疗是让条件增殖腺病毒（Conditionally replicative adenovirus，CRAds）携带治疗基因，利用CRAds的特异性增殖能力，使治疗基因在肿瘤细胞内成千上万倍的增加，同时CRAds本身也有肿瘤杀伤作用。构建CRAds的方法之一是将腺病毒在正常细胞中复制必需，而在肿瘤细胞中复制不需要的基因如E1B 55Kda蛋白基因删除。目前携带siRNA的CRAds治疗肿瘤研究仅有几篇报道，其中用于肾癌的研究尚未见报道，本研究将针对肿瘤增殖基因Ki67的siRNA插入CRAds构建ZD-Ki67，体外及动物实验研究其对肾癌的靶向治疗作用。第一部分Ki67 siRNA有效序列的确定、表达载体的构建及其对肾癌的治疗作用合成针对Ki67 cDNA 364～382碱基的Ki67-siRNA，将Ki67-siRNA（100nmol／L）转染人肾癌786-0细胞。采用RT-PCR、Westernblot、免疫细胞化学技术检测不同水平的Ki67表达，MTT法检测细胞增殖，免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果发现，Ki67-siRNA处理组786-0细胞Ki67表达降低，细胞增殖抑制率增加，凋亡细胞阳性率增加。结果表明我们筛选的Ki67-siRNA能抑制肾癌细胞Ki67基因表达，进而抑制其增殖，促进其凋亡。根据确定的序列，构建Ki67-siRNA表达质粒，并研究其对人肾癌细胞Ki67基因表达及生长的抑制作用。设计有小发夹机构的二条Ki67-siRNA对应模板DNA序列，煺火处理后克隆至pSilencer 3.1质粒，构建重组质粒pSilencer-Ki67。酶切及测序证实后将pSilencer-Ki67转染人肾癌786-0细胞及荷786-0裸鼠，结果发现pSilencer-Ki67可显著抑制786-0细胞及移植瘤组织Ki67表达，进而抑制其增殖、促进其凋亡。为我们构建携带Ki67-siRNA的CRAds打下基础。第二部分荷载Ki67 siRNA的条件增殖腺病毒的构建虽然Ki67-siRNA及其表达质粒可以有效抑制Ki67表达，但作用时间短暂是其致命缺陷，为此，我们构建了荷载Ki67-siRNA的条件增殖型腺病毒。将Ki67-siRNA模板克隆至pCA13质粒，构建重组质粒pCA13-Ki67。用BglⅡ从pCA13-Ki67酶切出包含CMV启动子及Ki67-siRNA模板的表达框，一并克隆进条件增殖腺病毒质粒pZD55，构建重组质粒pZD-Ki67。将pCA13-Ki67、pZD-Ki67与腺病毒右臂质粒pBHGE3共转染293细胞，包装成复制缺陷型腺病毒Ad-Ki67和条件增殖腺病毒ZD-Ki67。扩增Ad-Ki67、ZD-Ki67，纯化、测定滴度。酶切分析、测序鉴定表明pCA13-Ki67、pZD-Ki67构建成功。PCR鉴定表明Ad-Ki67包含目的基因，且E1区缺失；ZD-Ki67包含目的基因，且无野生型腺病毒污染。Ad-Ki67、ZD-Ki67滴度分别为4×1010、1×1011PFU／ml。结果证实成功构建携带Ki67-siRNA的条件增殖型腺病毒ZD-Ki67，为靶向治疗肿瘤奠定基础。第三部分荷载Ki67 siRNA的条件增殖腺病毒抑制肾癌细胞的体内外研究首先研究ZD-Ki67在肾癌细胞内选择性复制能力。用相同滴度（MOI=1）的表达EGFP的ZD-EGFP、Ad-EGFP分别感染786-0细胞，1d和5d后荧光显微镜下观察发现，ZD-EGFP感染5d的786-0细胞大多数发生明显细胞病变，表达EGFP细胞数目及荧光强度也大大高于Ad-EGFP感染的细胞。而ZD-EGFP感染的人肾小管HK2细胞没有发生病变。Western blot检测E1A表达，发现ZD-Ki67、ZD-EGFP感染的肾癌786-0、ACHN细胞检测到E1A表达，Ad-Ki67感染细胞无E1A表达。结果表明，ZD-Ki67可在肾癌细胞内选择性复制。在此基础上研究ZD-Ki67对肾癌细胞的影响。将不同MOI的ZD-Ki67、Ad-Ki67、ZD-EGFP感染肾癌786-0、ACHN细胞，分别于不同时间收集肿瘤细胞，结晶紫染色检测病毒对肾癌细胞的毒性作用，MTT法检测细胞增殖，TUNEL法检测细胞凋亡，分别采用RT-PCR、Western blot及细胞免疫化学检测Ki67表达。结果发现，对786-0、ACHN细胞杀伤及增殖抑制作用强度依次为ZD-Ki67＞ZD-EGFP＞Ad-Ki67。诱导786-0、ACHN细胞凋亡能力及抑制Ki67表达作用依次为ZD-Ki67＞Ad-Ki67＞ZD-EGFP。结果表明，病毒ZD-Ki67可在肾癌细胞内选择性地增殖，并杀伤肾癌细胞、诱导其凋亡。为证实ZD-Ki67对荷肾癌小鼠肿瘤治疗作用，786-0细胞荷瘤裸鼠移植瘤内分别注射7×108PFU的病毒ZD-Ki67、ZD-EGFP、Ad-Ki67及生理盐水，连续注射3天，每组10只。10天后每组随机处死4只裸鼠，免疫组化及激光共聚焦显微镜检测移植瘤组织Ki67及E1A蛋白表达；TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡；其余动物每周测量肿瘤体积，连续观测9周。结果发现ZD-Ki67、Ad-Ki67、ZD-EGFP及生理盐水处理组肿瘤体积（mm3）分别为：135.5±9.2、1267.4±59.8、1711.3±75.2、2616.1±245.1，各组之间差异有统计学意义。Ad-Ki67处理组肿瘤无E1A蛋白的表达，ZD-EGFP、ZD-Ki67处理组有大量E1A蛋白的表达，表明病毒复制。抑制Ki67表达作用依次为ZD-Ki67＞Ad-Ki67＞ZD-EGFP＞生理盐水组。移植瘤细胞凋亡阳性率依次为ZD-Ki67＞Ad-Ki67＞ZD-EGFP＞生理盐水组。结果表明，ZD-Ki67可以在裸鼠人肾癌移植瘤组织内复制，抑制移植瘤的生长，同时抑制Ki67蛋白的表达，促进细胞凋亡。为ZD-Ki67应用于肾癌靶向性基因治疗研究奠定基础。