【摘 要】
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叶蝉是竹类植物上重要的刺吸类昆虫之一,近年来对竹类植物的危害呈上升趋势,大多数种类为重要的农林害虫,具重要的经济意义。针对竹子叶蝉种类繁多,体型小,部分类群的外形与生殖结构极其相似,传统分类方法鉴定困难等问题,本文对中国竹子叶蝉展开了DNA条形码研究,主要内容包括:DNA条形码候选基因的筛选、构建DNA条形码数据库、基于筛选的DNA条形码对部分类群的分类地位的验证及新分类单元的验证。主要研究结果如
【基金项目】
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中国重要竹子害虫额垠叶蝉族的区系分类、DNA条形码及系统发育研究（31660209）,国家自然科学基金地区科学基金项目； 中国竹子叶蝉区系、分类及 DNA 条形码研究（31860209）,国家自然科学基金地区科学基金项目；
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叶蝉是竹类植物上重要的刺吸类昆虫之一,近年来对竹类植物的危害呈上升趋势,大多数种类为重要的农林害虫,具重要的经济意义。针对竹子叶蝉种类繁多,体型小,部分类群的外形与生殖结构极其相似,传统分类方法鉴定困难等问题,本文对中国竹子叶蝉展开了DNA条形码研究,主要内容包括:DNA条形码候选基因的筛选、构建DNA条形码数据库、基于筛选的DNA条形码对部分类群的分类地位的验证及新分类单元的验证。主要研究结果如下:1.候选DNA条形码的筛选针对COI、16S r RNA和Cytb三个线粒体基因序列,28S r DNA的D2-D3与D9-D10两个核基因序列区段,运用DNA barcoding gap的距离法、条形码间隙自动检索法ABGD等方法,开展了竹子叶蝉物种鉴定适宜条形码筛选。结果显示,在物种区分效率上16S r RNA效果较佳;此外,COI基因片段平均种间遗传距离是种内的10倍以上,且在ABGD分析中效果优于其他基因。因此,初步选择16S r RNA作为竹子叶蝉DNA条形码的最适基因片段,COI基因作为备选基因。基于16S r RNA基因序列的竹子叶蝉昆虫的种内、种间与属间的遗传距离具有明显的差异。种内遗传距离为0.000-0.008,种间遗传距离为0.095,属间遗传距离为0.156-0.326;种间平均遗传距离与种内差异倍数大于10倍以上,有明显的条形码间隔;BI系统发育树亦清晰地显示了不同地理区域的同一物种较好地聚为一支,不同属的分支区分明显,且支持度较高,分析结果进一步验证了16S r RNA基因序列是适用于竹子叶蝉物种鉴定的DNA条形码。2.DNA条形码数据库的构建据DNA条形码的筛选可知,物种区分效率上16S r RNA基因序列效果较好,COI可作备用基因。成功获得最适基因片段16S r RNA共7亚科37属53种82条序列,其中一种未鉴定到亚科:横脊叶蝉亚科4属4种10条序列;小叶蝉亚科已鉴定3属3种12条序列,待定种为2属2种2条序列;离脉叶蝉亚科1属3种3条序列;广头叶蝉亚科1属1种6条;叶蝉亚科2属2种2条序列;耳叶蝉亚科2属2种3条;1种1条序列未鉴定到亚科;角顶叶蝉亚科鉴定到属21个,26种34条序列鉴定到种,其中9种9条序列未鉴定到种。获得备用基因COI共7亚科39属58种90条序列,其中1种未鉴定到亚科。初步构建了中国竹子叶蝉的DNA条形码数据库。3.基于DNA条形码对部分类群的分类地位的验证基于16S r RNA基因序列,通过计算遗传距离与构建BI系统发育树,对部分类群的分类地位进行了验证,结果表明:额垠叶蝉属Mukaria:属内种间遗传距离为0.050-0.213,沿河额垠叶蝉M.yanheensis与黑额垠叶蝉M.nigra的最大,为0.213,大于DNA条形码研究结果中最大的种间遗传距离0.200,表明该属存疑。BI树中沿河额垠叶蝉M.yanheensis与其他物种的亲缘关系较远;同一物种的不同地理种群皆聚为一支;斑翅额垠叶蝉M.maculate与黑额垠叶蝉M.nigra聚为一支;待定种M.sp.1与亮黑额垠叶蝉M.splendida亲缘关系极近,互为姊妹群;其他物种皆独聚一支。综上所述,表明额垠叶蝉属并非单系群,部分物种分类地位存疑,沿河额垠叶蝉M.yanheensis或可另置他属。本叶蝉属Benglebra和痕叶蝉属Mohunia:本叶蝉属Benglebra的种间遗传距离为0.089-0.188,片突本叶蝉B.biflaka与待定种B.sp.2的最大,为0.188,接近DNA条形码研究结果中最大的种间遗传距离0.200。痕叶蝉属Mohunia的种间遗传距离为0.187,亦非常接近0.200。两属间的遗传距离为0.179。属间遗传距离与种间遗传距离出现重叠,表明两属存疑。结合BI树的结果,片突本叶蝉B.biflaka与内突本叶蝉B.introspina共聚一支,不同地理区域的腹突本叶蝉B.ventrospina共聚一支,与（片突本叶蝉B.biflaka 186+内突本叶蝉B.introspina 183）形成姊妹群。待定种B.sp.2独聚一支。痕叶蝉属Mohunia的双带痕叶蝉M.bifasciana与待定种M.sp.1虽共聚一支,但概率值较低,可靠性不高。故认为这两属单系性的准确性不高,部分物种分类地位存疑,双带痕叶蝉M.bifasciana或可归于本叶蝉属中。4.基于DNA条形码对新分类单元的验证本文依据形态学特征,建立了3个新种,分别隶属于刺突叶蝉属Neurotettix、锥头叶蝉属Onukia、凸冠叶蝉属Convexana。此外,基于备选COI基因序列,近缘属种间的遗传距离和BI系统发育树结果显示,各新单元的聚类情况与遗传距离的结果保持一致。从分子水平上验证了新单元的成立。新的分类单元为:刺突叉索叶蝉Neurotettix spinas sp.nov.;狭直锥头叶蝉Onukia angustarecta sp.nov.;宽突凸冠叶蝉Convexana lataattribuere sp.nov.。
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