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目的:成纤维细胞生长因子18(FGF18)是成纤维细胞生长因子家族(FGFs)的重要成员之一。大量的研究成果表明,FGF18参与骨骼发育的过程。过往FGF18关于骨相关疾病作用的研究多集中在软骨形成上,而对成骨细胞的功能障碍和死亡作为重要诱因的骨质疏松症方面的作用却很少有相关研究报道。骨质疏松症作为一种常见的全身性骨骼疾病,其主要特征在于骨骼构建(合成代谢)和再吸收(分解代谢)之间的不平衡,导致骨脆性和骨折风险增加。绝经后骨质疏松症(PMOP)是最常见的骨质疏松症类型之一,主要是由机体雌激素缺乏所诱发的。本课题在实验室前期完成FGF18基因重组表达和蛋白纯化的基础上,开展体外和体内实验研究其对骨质疏松的作用及其相关机制。本课题在体外实验中,初步探讨了外源性rhFGF18蛋白对MC3T3-E1成骨细胞的促增殖作用与机制,并建立了成骨细胞氧化应激模型,探讨rhFGF18对氧化损伤成骨细胞的保护作用以及相关信号转导机制;在体内实验中,对ICR小鼠进行卵巢切除术(OVX)建立PMOP模型,并应用Micro-CT及HE染色分析rhFGF18的相关作用。本课题研究成果将有助于了解FGF18在骨质疏松症修复中的积极作用及相关的作用机制,并为FGF18的未来临床应用提供相关实验数据。
方法:1:采用MTT法分别检测rhFGF18蛋白对NIH3T3细胞与MC3T3-E1细胞的促增殖作用,评估rhFGF18蛋白生物学活性与细胞活力。
2:Western blot分析相关蛋白的表达水平变化,初步探究rhFGF18促MC3T3-E1细胞增殖作用的机制。
3:应用H2O2建立MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤模型,并应用MTT法检测细胞活力以及流式细胞术检测细胞凋亡情况,评估rhFGF18对成骨细胞凋亡的影响。Western blot分析与凋亡相关蛋白的表达水平变化,初步探究rhFGF18保护MC3T3-E1氧化应激损伤作用的机制。
4:对ICR小鼠行卵巢切除术建立PMOP模型,并应用ELISA法、Micro-CT以及HE染色,分析rhFGF18对OVX小鼠的骨代谢、骨形态学参数以及骨形态结构的影响作用。
结果:1:MTT结果表明,rhFGF18蛋白能够显著促进NIH3T3细胞以及MC3T3-E1细胞的增殖,说明蛋白生物学活性与细胞活力良好。给药组中p-ERK1/2与p-p38较空白对照组显著表达,而p-JNK1/2/3无明显差异,表明rhFGF18促进MC3T3-E1细胞增殖作用与ERK和p38蛋白相关,而与JNK无关。
2:MTT检测与流式细胞术分析结果证明rhFGF18蛋白可以增强H2O2氧化损伤的MC3T3-E1细胞活力,并降低细胞凋亡率。随后,Western blot检测发现,rhFGF18能够降低氧化损伤成骨细胞中caspase3与Bax蛋白的表达水平,增强Bcl-2蛋白表达,并增加p-ERK1/2与p-p38蛋白表达,表现抗凋亡作用。
3:ELISA检测结果表明,rhFGF18能够改善OVX小鼠骨代谢情况,具体表现为与模型组比较,给药组OVX小鼠血清中雌二醇(E2)含量升高,骨碱性磷酸酶(BALP)含量升高,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)含量降低。
4:Micro-CT与HE结果显示,OVX改变了小鼠股骨的骨小梁结构、骨密度(BMD)降低、骨体积分数(BV/TV)减小、骨小梁数(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)减少、骨小梁分离度(Tb.Sp)和结构模式指数(SMI)增加,而给予rhFGF18治疗则明显改善了上述指标。
结论:本课题证明了rhFGF18能够通过刺激MC3T3-E1成骨细胞增殖,并抑制细胞凋亡保护其减少氧化应激的损伤,有效改善OVX小鼠骨代谢,从而防止OVX小鼠的骨丢失。
方法:1:采用MTT法分别检测rhFGF18蛋白对NIH3T3细胞与MC3T3-E1细胞的促增殖作用,评估rhFGF18蛋白生物学活性与细胞活力。
2:Western blot分析相关蛋白的表达水平变化,初步探究rhFGF18促MC3T3-E1细胞增殖作用的机制。
3:应用H2O2建立MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤模型,并应用MTT法检测细胞活力以及流式细胞术检测细胞凋亡情况,评估rhFGF18对成骨细胞凋亡的影响。Western blot分析与凋亡相关蛋白的表达水平变化,初步探究rhFGF18保护MC3T3-E1氧化应激损伤作用的机制。
4:对ICR小鼠行卵巢切除术建立PMOP模型,并应用ELISA法、Micro-CT以及HE染色,分析rhFGF18对OVX小鼠的骨代谢、骨形态学参数以及骨形态结构的影响作用。
结果:1:MTT结果表明,rhFGF18蛋白能够显著促进NIH3T3细胞以及MC3T3-E1细胞的增殖,说明蛋白生物学活性与细胞活力良好。给药组中p-ERK1/2与p-p38较空白对照组显著表达,而p-JNK1/2/3无明显差异,表明rhFGF18促进MC3T3-E1细胞增殖作用与ERK和p38蛋白相关,而与JNK无关。
2:MTT检测与流式细胞术分析结果证明rhFGF18蛋白可以增强H2O2氧化损伤的MC3T3-E1细胞活力,并降低细胞凋亡率。随后,Western blot检测发现,rhFGF18能够降低氧化损伤成骨细胞中caspase3与Bax蛋白的表达水平,增强Bcl-2蛋白表达,并增加p-ERK1/2与p-p38蛋白表达,表现抗凋亡作用。
3:ELISA检测结果表明,rhFGF18能够改善OVX小鼠骨代谢情况,具体表现为与模型组比较,给药组OVX小鼠血清中雌二醇(E2)含量升高,骨碱性磷酸酶(BALP)含量升高,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)含量降低。
4:Micro-CT与HE结果显示,OVX改变了小鼠股骨的骨小梁结构、骨密度(BMD)降低、骨体积分数(BV/TV)减小、骨小梁数(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)减少、骨小梁分离度(Tb.Sp)和结构模式指数(SMI)增加,而给予rhFGF18治疗则明显改善了上述指标。
结论:本课题证明了rhFGF18能够通过刺激MC3T3-E1成骨细胞增殖,并抑制细胞凋亡保护其减少氧化应激的损伤,有效改善OVX小鼠骨代谢,从而防止OVX小鼠的骨丢失。