束缚-浸水应激(restraint water-immersion stress,RWIS)是一种同时使心理及生理方面接受刺激的应激模型,该应激可以引起大鼠恐惧、愤怒、焦虑和绝望等情绪上的变化以及胃运动加剧、胃酸分泌量增多和胃黏膜血流量减少等胃肠机能的紊乱,从而导致大鼠胃黏膜损伤,该应激模型常用于应激性胃溃疡发生机制的研究。肠-脑轴是胃肠道与中枢神经系统相互作用的双向调节轴,脑的各级中枢接受来自胃肠道的各种传入信息,整合后通过自主神经系统调控胃肠道内的效应细胞,从而对胃肠黏膜、血管、腺体、平滑肌和肠道微生物等起调节作用。我们前期研究发现束缚-浸水应激导致下丘脑的室旁核、脑干的孤束核(NTS)和迷走神经背核(DMV)以及胃肠肌间神经丛内c-Fos蛋白的表达均明显增加,表明肠-脑干轴参与了束缚-浸水应激过程,但肠-脑干轴中哪类神经元参与了应激过程,还尚不明确。5-HT是一种在脑和消化道内广泛存在的神经递质,在调节肠-脑之间的信息通讯以及胃肠功能方面起重要的作用。当胃肠道受到压力或者是化学等方面的刺激时,一方面肠嗜铬细胞会释放大量的5-HT并与相应的受体结合,将胃肠感觉信息通过迷走神经上传至脑;另一方面来自中缝核群等核团的神经元释放5-HT和NTS、DMV上的受体结合,调节胃肠功能。那么,1.肠-脑干轴5-HT信号系统是否参与RWIS过程,胃肠道以及脑干中5-HT合成酶、受体和转运体在RWIS各时间段有什么变化?2.孤束核注射5-HT3R抑制剂帕洛诺斯琼对肠道肌间神经丛中各神经元活性以及胃肠道功能有什么样的影响?针对以上问题设计了如下实验:实验研究一:根据应激时间的不同,把实验大鼠分为三组,对照组、RWIS 1h组、和RWIS 3h组,分别用免疫组织化学、Western Blot和qRT-PCR技术检测大鼠结肠肌间神经丛、中缝大核(DR)、中脑导水管腹外侧(vlPAG)及脑干NTS和DMV中5-HT、5-HT3R、5-HT4R、SERT、TPH的表达,以探究肠-脑干轴中5-HT是否参与RWIS过程。实验研究二:将大鼠分为对照组、RWIS1h组、RWIS1h+生理盐水组、RWIS1h+帕洛诺斯琼组(5-HT3R受体的抑制剂)。用免疫组织化学和Western Blot技术检测大鼠结肠肌间神经丛内p-ERK1/2、GFAP、ChAT和NOS的表达,探讨5-HT对肠道内神经元活性及神经递质的影响。实验研究三:分组同实验二,用Western Blot和ELISA技术来检测实验大鼠结肠内闭合蛋白Occludin、骨架蛋白Claudin-1,胃黏蛋白MUC5AC的表达,并观察胃溃疡的损伤状况,以此来讨论5-HT对胃肠功能有什么样的影响。研究结果发现:1.RWIS3h组结肠肌间神经丛与脑干NTS、DMV中5-HT3R的表达量与对照组相比明显增多,差异显著(P<0.01);RWIS3h后,DR和vlPAG中5-HT和TPH的表达以及结肠肌间神经丛中TPH的表达与对照组相比显著升高(P<0.01);而RWIS3h后结肠肌间神经丛与脑干NTS、DMV中5-HT4R、SERT以及DR和vlPAG中SERT的表达与对照组相比明显降低且差异性显著(P<0.01)。这些结果表明5-HT信号系统参与了RWIS过程。2.免疫组化与Western Blot实验结果发现,与RWIS1h+生理盐水组相比较,RWIS1h+帕洛诺斯琼组结肠肌间神经丛中p-ERK1/2、GFAP、ChAT和NOS的表达均降低且差异显著(P<0.01)。说明在RWIS过程中,脑干5-HT系统被激活,通过结合孤束核5-HT3R调控肠道肌间神经丛内神经元和星形胶质细胞的活性。3.胃损伤检测与ELISA实验结果表明,与RWIS1h+生理盐水组相比较,RWIS1h+帕洛诺斯琼组中胃粘膜损伤程度明显减轻,胃内MUC5AC的表达升高且差异著性(P<0.01),Western Blot实验结果发现,结肠中Claudin-1和Occludin的表达明显降低(P<0.01)。这些结果表明,在RWIS过程中,脑干内5-HT信号系统被激活,通过结合孤束核5-HT3R,影响肠道肌间神经丛内神经元和星形胶质细胞的活性,导致胃肠道功能的紊乱。