第一部分CCND1基因在乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌中的甲基化状态及其与预后关系的研究研究背景原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）为我国常见恶性肿瘤,位于致死性疾病前列。该病的癌细胞来源于肝细胞,起病隐匿,早期缺乏典型症状。2020年,原发性肝癌居全球常见癌症第六位和癌症死亡原因第三位,新发病例约90.6万例,死亡病例约83万例。原发性肝癌患者预后较差,5年生存率仅18%。在我国,约90%的肝癌患者有乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染的背景。慢性肝病患者存在持续的肝脏炎症、纤维化和异常肝细胞再生,继而引起肝硬化和一系列表观遗传学事件,最终导致癌前病变（异常增生结节）的形成。DNA 甲基化（DNA methylation）指 DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）催化DNA序列上特定的碱基,S腺苷甲硫氨酸（S adenosyl methionine,SAM）提供甲基,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位通过共价结合的方式获得一个甲基基团从而形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过程。基因启动子甲基化异常可导致癌基因激活、抑癌基因失活,继而引起基因表达异常,促进肿瘤的发生发展。随着对肝癌发生机制的认识不断加深,研究者揭示DNA启动子甲基化改变与其形成和发展的密切关系。这种表观遗传学改变在生物学上是稳定的,并存在于循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA,ctDNA）中,使其适用于肿瘤的早期检测和无创动态监测。美国哈弗大学医学院MotokuraT教授等人在染色体11q13上发现了一个候选癌基因PRAD1,随后发现该基因的互补DNA编码一种由295个氨基酸组成的蛋白质,其序列与细胞周期蛋白相似。现将该基因命名为CCND1基因,编码的蛋白质称为Cyclin D1。作为细胞周期依赖性激酶（Cyclindependentkinase,CDK）4和6的调节亚单位,Cyclin D1的功能主要是促进细胞增殖。CCND1基因过表达影响细胞周期进程,并可能导致肿瘤发生。然而,CCND1基因启动子甲基化状况及mRNA表达水平在HBV-HCC的诊断和预后中的作用,仍需进一步阐明。活性氧（Reactive oxygen species,ROS）是一类含有氧自由基的高活性物质。活性氧的产生和抗氧化防御之间失衡则引起氧化应激（Oxidative stress）,进而导致细胞功能障碍和组织损伤,然而氧化应激水平过高能够诱发肿瘤。研究表明,氧化应激引起的DNA损伤导致大量DNA低甲基化,促进HCC的进展,然而氧化应激与CCND1启动子甲基化之间的关联尚不清楚。研究目的1.探究HBV-HCC患者、慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者、正常对照（Healthy controls,HCs）血浆DNA中CCND1基因启动子甲基化状况。2.探究CCND1基因启动子甲基化状况在HBV-HCC患者、AFP阴性的HBV-HCC患者和AFP阳性CHB患者中的诊断和预后价值。研究方法本研究纳入于2016年5月至2018年7月在山东大学齐鲁医院肝病科住院或门诊就诊的HBV-HCC患者105例、CHB患者54例。此外,本研究纳入32例健康志愿者作为正常对照。甲基化特异性聚合酶链式反应（Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）用于检测所有患者及正常对照血浆DNA的CCND1启动子甲基化状态。实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）用于检测所有患者及正常对照外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中 CCND1 mRNA 表达水平。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assays,ELISAs）用于检测血浆中超氧化物歧化酶（SOD）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）和丙二醛（MDA）水平。研究结果1.HBV-HCC患者CCND1启动子甲基化频率显著低于CHB患者和HCs（χ2=25.520,P＜0.001;χ2=31.219,P＜0.001）。2.CCND1启动子甲基化频率与SOD、8-OHdG和MDA水平呈显著负相关（rs=-0.533,P＜0.001;rs=-0.324,P=0.001 和 rs=-0.526,P＜0.001）。3.CCND1启动子甲基化状态诊断HBV-HCC的受试者工作特征曲线下面积（Area under the receiver operating characteristic,AUROC）显著高于甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）（0.705 vs 0.531,P＜0.05）。CCND1启动子甲基化与AFP联合检测诊断HBV-HCC的AUROC明显高于CCND1启动子甲基化或AFP单项检测。4.对AFP阴性HBV-HCC患者的诊断,CCND1启动子甲基化的AUROC显著高于AFP（0.717 vs 0.559,P＜0.05）;对AFP阳性CHB患者的诊断,CCND1启动子甲基化的 AUROC 显著高于 AFP（0.881 vs 0.800,P＜0.05）。5.HBV-HCC患者中,CCND1 mRNA的表达水平显著高于CHB患者和HCs（Z=-4.946,P＜0.001 和 Z=-6.819,P＜0.001）。HBV-HCC 患者中,CCND1 启动子甲基化组的CCND1 mRNA表达水平显著低于CCND1启动子非甲基化组（Z=-2.268,P=0.023）;CCND1启动子甲基化频率与其mRNA表达水平呈显著负相关关系（Z=-0.213,P=0.032）。6.相比于CHB患者和HCs,HBV-HCC患者血浆中氧化损伤和抗氧化损伤指标（MDA、SOD和8-OHdG）的水平均显著增加（P＜0.05）。HBV-HCC患者中,CCND1启动子甲基化组的氧化损伤和抗氧化损伤指标（MDA、SOD和8-OHdG）的水平均低于CCND1启动子非甲基化组（P＜0.05）。7.HBV-HCC患者中,CCND1启动子甲基化组的总生存期（Overall survival,OS）高于CCND1启动子非甲基化组（P=0.012,log-rank检验）。单因素和多因素Cox回归分析结果表明,血浆8-OHdG水平、CCND1启动子甲基化频率和TNM分期是影响HBV-HCC患者预后的独立危险因素。8.CCND1启动子甲基化HBV-HCC患者的无进展生存期（Progression-free survival,PFS）高于 CCND1 启动子非甲基化 HBV-HCC 患者的 PFS（HR=0.109,95%CI:0.031-0.384）。结论HBV-HCC患者的CCND1启动子甲基化频率显著低于CHB患者和HCs,而CHB患者与HCs的CCND1启动子甲基化频率无显著差异。HBV-HCC患者中,CCND1启动子非甲基化组的mRNA表达水平高于CCND1启动子甲基化组。HBV-HCC患者血浆氧化损伤和抗氧化损伤指标（MDA、SOD和8-OHdG）的水平均高于CHB患者和HCs。CCND1启动子甲基化HBV-HCC患者的血浆MDA、SOD和8-OHdG水平均低于CCND1启动子非甲基化HBV-HCC患者。CNND1启动子甲基化状况对HBV-HCC患者的诊断价值优于AFP,并且是影响HBV-HCC患者预后的独立危险因素。CCND1启动子甲基化HBV-HCC患者的OS高于CCND1启动子非甲基化HBV-HCC患者。CCND1启动子甲基化状况与氧化应激相关,在疾病的发生发展过程中具有重要的生物学作用,对HBV-HCC有较好的诊断和预测预后价值。第二部分Ran基因表达水平和启动子甲基化水平及其对原发性肝细胞癌诊断和预后的影响研究背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌的主要组织学类型。HCC恶性程度高,临床症状明显的患者,病情多已处于中晚期。中国作为肝癌高发国家,新发和死亡病例超过全球50%。据统计,2014年中国肝癌新增病例约36.48万例,肝癌死亡病例约31.88万例。虽然近年来HCC的年龄标化发病率有所下降,但仍然是影响国民健康的高发肿瘤之一,成为困扰医疗界的一大难题。目前血清甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）已广泛用于HCC的普查、诊断、评估治疗效果和预测复发,然而AFP异常主要出现在疾病的晚期阶段。有研究指出,血清AFP在筛选HCC时的假阳性率和假阴性率比较高,以及在鉴别诊断HCC和肝脏良性疾病时受限。部分HCC患者血清AFP水平不升高,病毒性肝炎等良性肝脏疾病的AFP水平亦可升高。在不同研究队列中,AFP的受试者工作特征曲线下面积（Area under the receiver operating characteristic curve,AUROC）处于 0.73 到 0.83 之间。HCC 的生物标志物研究对于早期诊断及预测预后具有重要的意义,临床亟需寻找有效的生物标志物以指导治疗和评估预后。恶性肿瘤的发生发展除涉及广泛遗传变化外,也与表观遗传学密切相关。表观遗传学改变存在于人类所有肿瘤中,目前已知它与基因改变共同驱动癌症发生。表观遗传学异常在癌症发展的各个阶段具有普遍性,因而可用于预测肿瘤风险状态、早期检测以及用作预后指标。DNA甲基化（DNA methylation）是研究的最为深入的一种表观遗传修饰方式。DNA去甲基化可能导致基因组不稳定和非整倍体增加,二者皆是癌症的典型特征。与体细胞突变检测相比,DNA甲基化分析在肿瘤识别方面具有独特优势,如更高临床敏感性、更大动态范围、更多甲基化靶区以及每个靶基因区内多个可改变的CpG位点。Ras相关核蛋白（Ras-related nuclear,Ran）是一种低分子量GTP结合蛋白,属于Ras超家族,在细胞核形成的早期与染色质结合,在真核细胞周期中发挥重要作用,参与调控有丝分裂纺锤体的组装、核膜形成和细胞周期检查点。与其他GTP酶相同,Ran依赖于GTP和GDP结合的构象变化,与效应蛋白相互作用并调节上述生物学过程。Ran过表达在多种肿瘤中均有报道,包括肾、乳腺、卵巢、肺和结肠癌及恶性胸膜间皮瘤等。然而,Ran在HCC癌组织和癌旁组织的表达情况尚未清楚,且Ran mRNA表达水平及其启动子甲基化水平在HCC的诊断及预测预后方面的价值需进一步阐明。研究目的1.分析HCC癌组织和正常肝组织中Ran mRNA的表达水平及其启动子甲基化水平。2.研究Ran mRNA的表达水平、启动子甲基化水平在HCC患者中的诊断和预后价值。3.探究Ran mRNA的表达水平与免疫细胞浸润和免疫基因的关系。研究方法通过肿瘤基因组计划（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库,分析Ran mRNA表达水平与Ran启动子甲基化水平之间的相关性,并探究Ran的mRNA表达水平及其启动子甲基化水平在HCC患者中的预后价值。通过肿瘤免疫浸润评估资源（Tumor Immune Estimation Resource,TIMER）数据库,研究Ran mRNA表达水平与免疫细胞浸润水平的关系。选择2019年12月至2020年11月于山东大学齐鲁医院住院的68例HCC患者,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）验证HCC癌组织和正常肝组织中Ran mRNA的表达水平。研究结果1.TCGA数据分析表明,Ran mRNA在HCC癌组织中的表达水平显著高于正常肝组织（P＜0.001）。qRT-PCR验证结果表明,HCC癌组织中Ran mRNA的水平高于正常肝组织（P=0.002）。2.Ran mRNA表达水平是影响HCC患者预后的独立危险因素（HR=1.943,95%CI:1.388-2.720）。3.Ran mRNA表达水平预测HCC患者1年、3年、5年死亡率的时间依赖性受试者工作特征曲线下面积（Area under the receiver operating characteristic curves,AUC）分别为 0.747,0.634 和 0.704。4.Kaplan-Meier分析结果表明,Ran mRNA高表达组的总生存期（Overall survival,OS）和无进展生存期（Progression-free survival,PFS）分别低于Ran mRNA低表达组的OS和PFS（P＜0.001）。5.Spearman秩相关分析结果表明,Ran启动子甲基化水平与Ran mRNA表达水平呈负相关（r=-0.36,P＜0.001）。6.CpG 位点 cg01060409、cg17629322、cg25201101、cg01758167 和 cg19847963 的甲基化水平与Ran mRNA表达水平均呈显著负相关（r=-0.26,P＜0.001;r=-0.36,P＜0.001;r=-0.33,P＜0.001;r=-0.16,P＜0.001 和 r=-0.23,P＜0.001）。7.CpG位点cg17629322和cg25201101高甲基化组的OS分别高于CpG位点cg17629322 和 cg25201101 低甲基化组的 OS（P＜0.05）,而 CpG 位点 cg01060409 和cg19847963高甲基化组的PFS分别高于CpG位点cg01060409和cg19847963低甲基化组的 PFS（P＜0.05）。8.与病理学分级3级和4级HCC患者相比,病理学分级1级HCC患者Ran mRNA表达水平低（P＜0.001和P＜0.05）。TNM Ⅰ期HCC患者的Ran mRNA表达水平显著低于TNMⅡ和Ⅲ期HCC患者的Ran mRNA表达水平（P=0.014和P＜0.001）。T1期HCC患者的Ran mRNA表达水平显著低于T2期和T3期HCC患者的Ran mRNA表达水平（P＜0.05和P＜0.001）。年龄≥65岁HCC患者癌组织的Ran启动子甲基化水平显著高于年龄＜65岁HCC患者癌组织的Ran启动子甲基化水平（P=0.041）。TNM Ⅰ期HCC患者癌组织的Ran启动子甲基化水平显著低于TNM Ⅱ和Ⅳ期HCC患者癌组织的Ran启动子甲基化水平（P=0.030和P=0.026）。T1期HCC患者癌组织的Ran启动子甲基化水平显著高于T2和T4期HCC患者癌组织的Ran启动子甲基化水平（P=0.049,P=0.048）。9.HCC患者癌组织的Ran mRNA表达水平与B细胞、CD4+T细胞、髓样树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的浸润水平呈显著正相关（P＜0.05）,与预后相关免疫基因有相关性。结论Ran在HCC癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,而与甲基化水平呈负相关;Ran mRNA表达水平、启动子甲基化水平与HCC的临床资料有相关性,且可能影响HCC患者预后。