石斛属是兰科植物的第二大属,我国有76种,有近40种可作药用。石斛药用始载于《神农本草经》,为我国传统名贵中药,具有益胃生津,滋阴清热的功效,主治热病伤津,胃痛干呕,肺燥干咳,腰膝软弱等症。石斛主要含有多糖类、黄酮类、联苄类、菲类、生物碱类、氨基酸等化学成分,现代研究表明,具有增强机体免疫力、抗肿瘤、促进消化液分泌、抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等药理作用。2015版《中国药典》石斛项下收载的石斛为金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎,并将铁皮石解单列。有瓜石斛是药用石斛的一种,收自《广东省中药材标准》(第一册),其为兰科植物金石斛属流苏金石斛Flickingeria Fimbriata(Bl.)Hawkes带假鳞茎的干燥全草,别名带瓜石斛,主产于广东(梅州地区)、广西、海南、云南、贵州等地。具有益胃生津,滋阴清热功效,临床用于阴伤津亏,口干烦渴,食少干呕,病后虚热,目暗不明。广东地区常将有瓜石斛替代石斛使用。目前对有瓜石斛的质量研究较少,主要以性状、显微鉴别为主,其质量控制指标研究尚未完善。中药特征指纹图谱技术是国内外公认最有效的中药质控方法。本研究采用中药高效液相色谱(HPLC)特征指纹图谱以及质谱(MS)联用技术结合指标成分的含量测定与薄层色谱鉴别(TLC)方法,为有效控制有瓜石斛的质量提供方法依据。目的:1、建立有瓜石斛药材HPLC特征图谱分析方法,分析药材与其水煎液特征图谱的相关性,评价主要特征成分的煎煮效果。2、采用HPLC-MS/MS鉴别有瓜石斛的主要特征成分,并建立其HPLC含量测定方法。3、建立有瓜石斛的TLC方法。方法:1、特征图谱主要筛选色谱条件、方法学考察以及对特征峰进行比对,拟定特征成分群;采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)生成特征图谱共有模式,以共有模式为对照,进行相似度分析。有瓜石斛药材和水煎液HPLC特征图谱分析,采用ZORBAX SB C18色谱柱;流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱;检测波长分别为220nm和340nm;柱温为35 ℃;流速为1mL/min。2、采用HPLC-MS/MS方法联合对照品液相色谱保留时间、紫外吸收光谱特征分析鉴定夏佛塔苷、异夏佛塔苷以及原儿茶酸,并采用HPLC法测定其含量。色谱柱均为ZorbaxSB-Aq;其中夏佛塔苷与异夏佛塔苷以乙腈-0.1%磷酸溶液(15:85)为流动相,检测波长为340nm,流速为0.8mL/min,柱温为35℃;原儿茶酸以乙腈-0.1%磷酸溶液(2:98)为流动相,检测波长为220nm,流速为1.0mL/min,柱温为3℃。3、采用两种TLC系统,使用聚酰胺薄膜,以水-乙醇-乙酸-丁酮-丙酮(6.5:2.2:1:1.3:0.5)展开系统展开,喷以3%三氯化铝试液的显色方法鉴别有瓜石斛中黄酮类成分的色谱;使用硅胶G薄层板,以三氯甲烷-甲醇-甲酸(9:1.8:0.5)展开系统展开,喷以5%三氯化铁乙醇的显色方法,鉴别原儿茶酸等酚酸类成分的色谱。成果:1、建立了有瓜石斛药材及其水煎液的HPLC特征图谱分析方法。(1)在220 nm检测波长下,12批有瓜石斛药材特征图谱分为4类,共标示出21～26个特征峰,有19个特征共同峰。其中第Ⅰ类5批有21个共有峰,相似度为0.950～0.988;第Ⅱ类3批有26个峰,相似度为0.943～0.987;第Ⅲ类3批有23个峰,相似度为0.977～0.988;第IV类1批与第III类相比,多一个特征峰,差异较大。在340 nm检测波长下,12批有瓜石斛可分2类,共标示出7～8个黄酮类特征峰,其中第Ⅱ’类11批标示出7个共有峰,相似度为0.966～0.988;第Ⅱ’类1批,比第Ⅰ’类多1特征峰,以11批模式为对照,其相似度仅为0.671。(2)采用与药材相同的色谱条件分析水煎液的特征图谱,在220 nm检测波长下,12批有瓜石斛煎剂特征图谱亦分为4类,同样能标示出药材的21～25个特征峰,有17个特征共同峰,各类特征峰基本一致,相对峰面积比值有差异。其中第Ⅰ类5批、第Ⅱ类3批、第Ⅲ类3批的相似度分别为0.906～0.972,0.955～0.986,0.979～0.989;第Ⅳ类1批与第Ⅲ类相比,多一个特征峰,差异较大。同类样品的相似度为0.906～0.989,相似度较高;不同类样品共有模式间的相似度仅为0.481～0.759,有明显差异。在340 nm检测波长下,12批有瓜石斛亦分为2类,同样能标示出7～8个黄酮类特征峰,各类特征峰基本一致。其中第Ⅰ ’类11批相似度为0.909～0.985;第Ⅱ’类1批,比第Ⅰ ’类多1特征峰,以11批模式为对照,其相似度仅为0.659。每批药材与其对应的水煎液之间的相似度分别为0.733～0.919,提示常规水煎煮工艺能保留大部分有瓜石斛的主要特征成分。2、采用HPLC-MS/MS鉴别了有瓜石斛中的3个成分(夏佛塔苷、异夏佛塔苷以及原儿茶酸),并建立了其含量测定方法。(1)夏佛塔苷、异夏佛塔苷的回归方程分别为y=1074.6x22.302(r=0.9999),y=959.0x-30.767(r=0.9999),分别在 0.188 μ g～2.261 μ g,0.220 μ g～2.635 μ g 范围内线性关系良好;平均加样回收率分别为100.2%,101.5%,RSD分别为0.40%(n=6),1.18%(n=6)。12批样品中夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量分别为0.244～1.469mg/g,0.307～1.630mg/g。(2)原儿茶酸的回归方程y=5567.4x-11.717,r=1.0000,0.055μg～1.100μg范围内线性关系良好;平均加样回收率为101.0%,RSD为2.54%(n=6)。12批市售样品含量在0.0374～0.203 mg/g范围内,差异相对较大。3、有瓜石斛中黄酮类成分TLC鉴别方法,能检出与夏佛塔苷、异夏佛塔苷相对应的斑点,共检出6个较明显的主斑点;原儿茶酸的薄层色谱鉴别方法检出了与原儿茶酸相对应的斑点。结论:1、有瓜石斛HPLC特征图谱分析方法准确可靠,重复性好,为有瓜石斛的质量控制提供了有效的方法依据。在340 nm检测波长下,黄酮类成分特征峰比较稳定,样品差异较小;在220 nm检测波长下,特征峰信息丰富,对鉴别有瓜石斛质量差异更具优势。有瓜石斛的水煎液基本能保留大部分有瓜石斛药材的主要特征成分,为有瓜石斛的物质基础研究提供了一定的参考依据。2、有瓜石斛的夏佛塔苷、异夏佛塔苷以及原儿茶酸HPLC含量测定方法准确可靠,分离度及重复性好,为有瓜石斛提供了有效的定量指标成分。3、有瓜石斛的TLC方法简便,黄酮类成分、原儿茶酸的薄层斑点清晰,为有瓜石斛的质量控制提供一定的鉴别依据。