骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSC)具有向多种中胚层及神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，包括向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉、韧带、肌腱、骨髓基质、甚至肝脏细胞和神经细胞等多种细胞与组织分化[1,2]。MSC具有采集方便、易于分离纯化及增殖，多代扩增后仍保持干细胞特性等优点。MSC终身存在于骨髓和其他组织器官中，负责组织的修复和更新。因此MSC愈来愈受到重视，成为干细胞研究的热点。MSC的研究进展给多种疾病的治疗诸如肿瘤、心脏病、糖尿病等提供了新的途径。 关节软骨缺损的治疗一直是临床上的难题。用自体的软骨细胞修复软骨缺损存在一些难以解决的问题，如软骨细胞稀少，取自自体将造成创伤，而异体软骨细胞将产生免疫排斥等问题。获得足够的种子细胞及制备性能优良的支架材料是两大关键问题。业已证明，MSC能在体内外分化为软骨细胞。MSC固有的优势和特性将在软骨组织修复中成为首选种子细胞，可通过取自自体且体外扩增的MSC植入体内修复重建软骨组织缺损。MSC既可修复关节软骨面的缺损，也可修复包括软骨下骨的关节软骨缺损，将MSC应用于软骨组织工程已成趋势。为此，本课题拟对兔MSC生物学特性进行初步研究，并建立了兔关节软骨缺损的动物模型，及用MSC/I型胶原海绵对其缺损进行移植治疗，以明确其治疗效果。 目的： 本研究通过探索MSC分离，提取培养的最佳方法，并用流式细胞仪检测细胞的表面标记物CD14、CD44的表达来鉴定细胞纯度，同时研究了细胞的生长曲线、最佳接种密度，细胞冻存与复苏，以达到对MSC的生物学特性的初步了解；并在体外通过常用的成骨、成软骨的诱导培养基进行诱导，以研究其是否具有多向分化的潜能；最后将MSC/I型胶原海绵复合物移植到兔关节软骨缺损处，以明确MSC对关节软骨缺损的修复作用，为今后临床研究应用MSC移植治疗关节软骨缺损打下实验基础。 方法： 1、MSC体外培养、扩增与鉴定通过淋巴细胞分离液分离获得MSC，在体外传代扩增培养，研究MSC在体外生长的基本特征，包括形态、冻存复苏等；用流式细胞术检测间充质干细胞常见的表面标记物，以证实MSC是否具有间充质干细胞的初步特征。 2、MSC的诱导分化与检测分别用成骨、成软骨的常用诱导培养基诱导MSC进行分化，2周后以Gomori钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色，3周后以VonKossa法进行矿化节结染色，从而证明MSC的成骨潜能的存在；用甲苯胺蓝染色，以证实MSC是否具有成软骨潜能。 3、MSC/I型胶原海绵复合物移植治疗兔关节软骨缺损的实验为明确MSC对缺损的软骨组织是否具有修复作用，并了解移植后MSC在修复的新生组织中是否继续存在，我们实施了兔的性别交叉移植实验。将雄兔的MSC与胶原海绵共培养6小时后，移植入雌兔的关节软骨缺损处，并将其另一侧作为对照侧，仅移植胶原海绵。分别在术后1、2、3、4、5个月后处死动物，取其关节软骨手术部位，先进行大体观察并按改良Pineda评分[1]进行判断，并对修复情况评分，然后进行各种检测，包括：1)切片，进行HE染色：2)SRY-PCR，SRY是Y染色体上的性别决定基因，通过PCR来检测组织内是否含有雄性的DNA，以此来明确新生组织中是否含有移植的雄性MSC分化或增值的细胞。 结果： 1、MSC原代细胞生长速度较慢，呈短梭形形态，传代后细胞生长较原代快，5天已经长满单层，体外能长期培养与扩增；生长曲线呈S型，兔骨髓MSC连续传代18代细胞没出现衰老征象；通过慢冻速融法冻存细胞，表明细胞可以用液氮保存，且不影响细胞的活力；流式检测细胞表面标记物提示MSC各代CD14呈阴性，CD44呈阳性，这符合间充质干细胞的特征。 2、MSC在体外成骨诱导3周时有明显的矿化节结沉淀，经VonKossa法染色后，结果呈阳性，Gomori钙钴法进行ALP染色，ALP水平明显增高，这结果均提示MSC具有向成骨分化的潜能。MSC在体外软骨诱导后进行甲苯胺蓝染色显示阳性，提示MSC具有软骨细胞分化的特点。 3、MSC/I型胶原复合物移植修复关节软骨缺损实验，大体观察：移植一个月以上，实验侧关节软骨缺损修复明显优于对照侧。切片HE染色：结果发现新生组织移植后2个月及以上，各组实验侧软骨缺损区为透明软骨样组织修复和充填，而对照侧填充组织主要为纤维软骨组织。SRY-PCR检测中发现，实验侧的新生组织中含有SRY基因，对照侧却无该基因，表明移植的MSC在新生组织修复中起十分重要的作用。可见，MSC/胶原海绵复合物能够促进关节软骨缺损的修复。MSC/胶原海绵复合物用于修复全厚度关节软骨缺损是可行和有效的。