本试验旨在研究早期鸡胚细胞活性物代替哺乳动物胚胎干细胞在皮肤损伤修复方面的临床应用效果。在试验中对种蛋进行孵化,提取早期鸡胚细胞活性物,制备成药膏应用于动物创伤试验,并通过同源性比对得出鸡与小鼠在创伤修复相关的细胞生长因子的蛋白活性成分上具有高度同源性。本试验意义在于探讨早期鸡胚细胞活性物的临床效果,为其在临床应用上提供新的思路和借鉴。1.早期鸡胚细胞的分离及活性物的提取为了确定最佳孵化时间和条件,本试验采用新鲜种蛋在温度为37℃,湿度为55%的培养箱中孵化,选取0h,24h,48h,72h的入孵蛋采用药勺法分离原代细胞,向提取物滴加瑞氏-吉姆萨染色液。结果显示,孵化72h是最佳分离时间。此期显微镜下可见早期的鸡胚细胞形态较圆,似球形,细胞较小,核较大。为了确定鸡胚活性物的提取方法,本试验将提取的鸡胚原代细胞分别在液氮(-196℃),-80℃,-20℃条件下进行反复冻融3次,并在37℃恒温水浴锅进行融解。结果显示:在液氮、-80℃的条件下观察冻融后的细胞其裂解率为分别为87%和85%,差异不显著,但是相对于-20℃裂解率70%,有显著差异。-80℃对于液氮而言操作简便,所以选取-80℃作为反复冻融条件提取鸡胚活性物以备后续试验用。2.软膏剂基质的确定为了探索O/W型基质软膏的最佳制作配方和工艺,本试验通过对外观性状、耐寒与耐热性试验、离心试验和p H值测定,筛选出适宜的乳化剂,经正交试验确定最佳处方。最佳配方和工艺为硬脂酸10g,白凡士林5g,羊毛脂1.5g,冰片1.0 g,液体石蜡3g为油相,加热至80℃;另称取甘油5g,吐温-80 5g,三乙醇胺0.7g,尼泊金乙酯0.06g,加蒸馏水调节油、水两相至100g,加热至85℃;待其完全溶解后,将油相缓慢加入水相中,不停地搅拌至乳化完全;当基质温度降至40℃左右时,加入10g提取物。最后在制作的活体动物皮肤破损模型上涂抹制备的膏剂进行刺激性试验,结果表明此膏剂对皮肤无刺激性,可以在动物临床实验上进行应用。3.动物创伤模型的建立为了探索早期鸡胚细胞活性物软膏对创伤修复的作用,构建昆明小鼠刀切伤,烫伤和眼部损伤模型,皮肤表面涂抹制备的早期鸡胚细胞活性物软膏以及眼部滴加早期鸡胚细胞活性提取物。结果显示:在烫伤模型中,涂抹软膏剂的伤口愈合比涂抹红霉素软膏组和对照组愈合快。在12d时,涂抹早期鸡胚细胞活性物膏剂组的创面面积为0.62cm2,创面愈合率为60.16%,对照试验组小鼠的创面面积为1.13cm2,创面愈合率为26.50%,差异极显著(p<0.01);在刀切伤口组中,涂抹早期鸡胚细胞活性物膏剂组与涂抹红霉素软膏组和空白实验组比较,其伤口愈合快,第7d时,涂抹自制膏剂组伤口长度为1.10cm,红霉素软膏组伤口长度为1.35cm,差异不显著,但对照组伤口为1.58cm,愈合情况差异显著(p<0.05);在眼部损伤模型中,滴加早期鸡胚细胞活性物提取液对小鼠眼部损伤具有修复作用,可抑制炎症反应,并且具有促进毛发生长的作用。本试验通过皮下注射、滴眼和皮肤表面涂抹不同的给药方式,探究早期鸡胚细胞活性物对小鼠机体的影响,测量小鼠体温,其体温上下波动均在0.5℃内,小鼠并未出现高热、过敏等免疫排斥现象。因此,早期鸡胚细胞活性物虽是异源物质,与小鼠存在较大的种族差异,但经蛋白序列比对,b FGF同源性高达90%、EGF和SCF为53%、VEGF为78%、IGF为76%、TGF-β为56%、PDGF为80%,其细胞活性成分具有高度同源性,且对于创伤修复有促进作用,可以应用于临床动物试验。