论文部分内容阅读
目的本研究一方面从临床收集骨关节炎(OA)患者关节液分析其中CTHRC1和IL-1β的含量,另一方面制备原代大鼠软骨细胞,用IL-1β处理诱发骨关节炎细胞模型,分析CTHRC1在骨关节炎患者软骨细胞凋亡中的分子机制。方法收集安徽医科大学第一附属医院(合肥)2012年6月至2016年4月间行膝关节置换术的OA患者(67.9±7.2岁,男:女,11:39)关节液标本(n=50)。同时采集安徽医科大学第一附属医院30例(62.8±11.2岁,男:女,1:4)无OA或其他关节疾病史的外伤患者关节液标本。采用ELISA试剂盒检测OA和创伤患者关节液中CTHRC1和IL-1β的表达水平。制备原代大鼠膝关节软骨细胞,用IL-1β处理诱发骨关节炎细胞模型,通过Western blot观察CTHRC1和JNK1/2的表达量变化,CCK-8试剂盒分析IL-1β作用后软骨细胞的增殖能力的变化,流式细胞术分析IL-1β作用后软骨细胞的凋亡比例变化,分析CTHRC1、IL-1β和JNK1/2信号通路在骨关节炎中的关系。随后使用表达CTHRC1和CTHRC1-sh RNA的慢病毒感染骨关节炎细胞模型,分析CTHRC1表达水平的变化对骨关节炎中软骨细胞凋亡的影响。结果OA患者关节液中CTHRC1和IL-1β的含量明显高于创伤患者。在OA患者的关节液中,CTHRC1水平比创伤组高,IL-1β水平高于创伤组(P<0.01)。分离获得的原代大鼠软骨细胞形态呈多角形,采用免疫组织化学鉴定显示其中软骨细胞标记物Collagen II和SOX9高表达,确认为软骨细胞。在培养基中加入适量IL-1β,成功建立了骨关节炎细胞模型,Western blot和荧光定量PCR检测显示IL-1β处理后软骨细胞中CTHRC1的表达水平增加,细胞增殖能力下降,且下降程度与IL-1β的含量呈正比。使用携带CTHRC1的慢病毒转染原代大鼠软骨细胞后,荧光定量PCR和Western blot实验的结果显示与对照组相比CTHRC1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01);Western blot分析显示CTHRC1的过表达能够显著激活JNK1/2通路,JNK1/2的抑制剂SP600125能够抑制这种激活状态。过表达CTHRC1的大鼠软骨细胞中caspase-3的活性均显著上调,凋亡细胞比例也显著升高(P<0.01),而JNK抑制剂SP600125能够显著降低过表达CTHRC1引起的细胞凋亡比例和caspase-3的活性升高(P<0.01);此外,Western blot结果提示在大鼠软骨细胞中上调CTHRC1的表达,能够促进MMP-13、Bax、PARP-1和cleaved caspase-3的表达(P<0.01),但抑制Bcl-2的表达,差异有统计学意义(P<0.01);JNK抑制剂SP600125处理大鼠软骨细胞后MMP-13、Bax、PARP-1和cleaved caspase-3的表达下降(P<0.01),Bcl-2的表达增加(P<0.01)。将表达CTHRC1sh RNA的慢病毒感染大鼠成软骨细胞后与未感染组相比CTHRC1的表达水平显著下降,再使用10ng/ml的IL-1β处理6h后p-JNK1/2和JNK1/2的表达水平显著上升(P<0.01);然而CTHRC1下调后p-JNK1/2和JNK1/2的表达水平显著下降了(P<0.01);流式细胞分析的结果表明下调CTHRC1凋亡比例显著下降(P<0.01)。通过western blot分析下调CTHRC1以及使用抑制剂SP600125后均能抑制IL-1β引起的软骨细胞凋亡。通过q RT-PCR和western blot分析显示与未转染组相比IL-1β组Bcl-2的表达明显降低(P<0.01),MMP-13、Bax、PARP-1和cleaved caspase-3的表达显著上升(P<0.01),但使用慢病毒下调CTHRC1表达或使用JNK抑制剂SP600125处理细胞后Bcl-2的表达显著上升(P<0.01),MMP-13、Bax、PARP-1和cleaved caspase-3的表达显著下降(P<0.01)。结论本研究的结果显示在IL-1β引起的大鼠骨关节炎细胞模型中抑制CTHRC1的表达能够通过JNK信号通路抑制软骨细胞凋亡;而上调CTHRC1的表达后情况正好相反。这些结果提示CTHRC1通过JNK信号通路参与了软骨细胞凋亡过程,CTHRC1可能作为治疗OA患者软骨再生的新靶点。