论文部分内容阅读
耐辐射动球菌(Kineococcus radiotoleran)是一种革兰氏阳性菌,分离自核污染废料堆,它具有对强碱、高盐、高金属离子浓度、高化学毒性、高渗透压以及γ射线等的极端抗性,其辐射抗性是因为K.radiotolerans自身高效而准确的DNA修复系统。RecBCD途径是细菌中主要的同源重组修复途径之一,作用于DNA双链断裂修复。DNA双链断裂(DSBs)修复对于细胞活性和同源重组具有重要的意义。sRNA(small non-coding RNA)在细菌中已被证实是基因表达的重要调节子,通常是缺少蛋白编码功能的,它作用于mRNA的翻译或降解,有时候也直接调节某种蛋白功能。sRNA对基因表达的调控主要是由sRNA与mRNA间基于短且不完全碱基互补配对的相互作用实现。对K.radiotoleran 按0、2、4、6、8、10、12kGy 辐照 4h 后进行 qRT-PCR分析,结果表明,随着辐照强度的增加,RecBCD的表达量也随之提高,表明RecBCD是与K.radiotolerans的抗辐射特性相关的蛋白。本论文针对由生物信息学软件预测出的可能与RecBCD 5’UTR发生相互作用的5条sRNA进行验证,分别是 sKRA059、sKRA214、sKRA155、sKRA051 和 sKRA125。由于尤radiotolerans存在细胞壁厚、生长抱团的问题,导致无法转入外源DNA,因此利用粘液素润滑抗粘附的特性解决K.radiotolerans抱团生长的问题,但在非抱团生长的基础上仍然无法转入外源DNA。利用大肠杆菌作为外源宿主,共转化含有RecBCD 5’UTR序列的绿色荧光蛋蛋报告质粒粒5’UTR::gfp)与含有sRNA的表达质粒,并通过流式分析以及Western blotting检测GFP的荧光表达与蛋白表达情况,以分析相关sRNA对RecBCD蛋白的调控机制。流式分析结果显示质粒共转化前后,GFP表达的荧光强度没有显著差异。Western blotting结果表明质粒共转化前后,GFP蛋白表达也没有明显差异,与流式分析结果相符。由此说明在大肠杆菌外源宿主内,sKRA059、sKRA214、sKRA155、sKRA051 和 sKRA125 与 RecBCD 5’UTR 不存在相互作用。