第一部分 AHI1缺失通过生物钟通路下调酪氨酸羟化酶表达造成小鼠抑郁样行为　　目的：　　脑内神经递质的减少是抑郁症病人的重要病理特征，而 Ahi1 （Abelson helper integration site 1）基因敲除（KO）小鼠的五羟色胺（5-HT）和多巴胺（DA）水平明显降低。本研究试图探索AHI1通过何种信号通路参与神经递质调控。　　方法：　　通过悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠的抑郁行为。利用 qRT-PCR 手段去检测5-HT和DA通路中的合成、代谢酶以及相关转运体的mRNA水平。利用免疫组化和免疫荧光的方法观察小鼠中脑腹侧被盖区（VTA）酪氨酸羟化酶（TH）神经元的数目和活性。体外培养Neuro-2a (N2a) 细胞系，用RNAiMax转染siRNA敲减Ahi1基因，构建AHI1缺陷细胞模型。用Lipo 2000转染EGFP-AHI1基因，构建AHI1过表达细胞模型。利用qRT-PCR和免疫印迹手段分别去检测相关基因的mRNA和蛋白水平。构建一系列野生型和突变体的报告基因质粒，在过表达AHI1的情况下，检测AHI1对这些基因启动子活性的影响。利用免疫共沉淀的方法，检测AHI1与BMAL1 （brain and muscle arnt-like protein 1）的转录因子 RORα (retinoid-related orphan receptor-alpha)是否有结合。利用免疫荧光的方法，检测AHI1与RORα是否有共定位。Ahi1 KO鼠中脑立体定位注射REV-ERBα抑制剂SR8278来改善小鼠抑郁。　　结果：　　与对照小鼠相比，Ahi1 KO小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间都显著性增加，证明Ahi1 KO小鼠有抑郁表型。通过qRT-PCR和免疫印迹实验发现， Ahi1 KO鼠中TH的mRNA和蛋白水平相比对照鼠显著降低。免疫组化和免疫荧光实验结果表明，Ahi1 KO鼠VTA区域TH神经元数目相比同窝杂合子小鼠无明显改变，而TH神经元活性明显降低。在 N2a细胞中分别过表达和敲低 Ahi1，通过免疫印迹和QPCR的方法检测蛋白和mRNA的含量，发现AHI1对TH同样有正调控的作用。报告基因实验也显示EGFP-AHI1可以显著性的提高TH启动子的活性。无论在白天还是夜晚，Ahi1 KO鼠TH蛋白的水平都比对照小鼠低。以上结果表明AHI1对TH有正调控作用。REV-ERBα和NURR1对TH有转录调控作用。　　接下来的研究发现，Ahi1 KO鼠中脑REV-ERBα的蛋白和mRNA水平都显著增加，而NURR1水平没有明显改变。在N2a细胞中敲减Ahi1同样导致REV-ERBα的蛋白及mRNA水平升高。REV-ERBα通过RORE反应元件抑制TH启动子的活性，我们构建了缺失RORE反应元件的TH报告基因质粒（mTH-Luc），发现AHI1对缺失RORE反应元件的TH启动子失去了激活作用。在细胞中敲减REV-ERBα可以显著升高TH的蛋白表达水平。无论在白昼还是夜晚，Ahi1 KO鼠中脑REV-ERBα的蛋白水平都比对照鼠高。EGFP-AHI1 可以抑制野生型 REV-ERBα 启动子的活性以及BMAL1/CLOCK所诱导的REV-ERBα启动子的活性，而不能影响缺失E-Box反应元件 REV-ERBα 启动子的活性。以上结果表明 AHI1 对 TH 的调控是通过负调控REV-ERBα实现的。　　在Ahi1 KO鼠中脑和Ahi1敲减细胞中，BMAL1的蛋白和mRNA水平均升高，而 CLOCK 水平无明显改变。免疫共沉淀实验和免疫荧光的实验结果表明 AHI1 与BMAL1的转录因子RORα有结合。EGFP-AHI1能抑制BMAL1启动子的活性，而如果将BMAL1启动子上的RORα反应元件RORE1和RORE2缺失，EGFP-AHI1就失去了对BMAL1启动子的抑制作用，说明AHI1通过RORα调控BMAL1。在N2a细胞中敲减Bmal1，TH蛋白和mRNA水平都增加，而REV-ERBα的蛋白和mRNA水平都减少。在敲减Bmal1的细胞中，再沉默Ahi1并不能引起REV-ERBα蛋白水平的增加和 TH 蛋白水平的降低，说明 AHI1 通过 BMAL1 调控 TH。在细胞中过表达BMAL1/CLOCK，可以明显降低TH启动子的活性，而对缺失REV-ERBα结合位点的TH启动子的活性无明显影响。在Ahi1 KO鼠中脑注射REV-ERBα抑制剂SR8278可以恢复TH神经元的活性，缩短Ahi1 KO鼠在悬尾实验中的不动时间，说明AHI1通过BMAL1/REV-ERBα调控TH。　　结论：　　AHI1通过生物钟RORα/BMAL1/REV-ERBα通路调控TH的转录表达从而参与情绪和行为调控。缺失AHI1使BMAL1/REV-ERBα表达增加，因而抑制了TH的表达和DA的合成，这导致了小鼠的抑郁行为。研究结果为临床治疗抑郁症提供了一定的理论和实验依据。　　第二部分 REV-ERBα激动剂通过NF-κB通路抑制小胶质细胞激活　　目的：　　REV-ERBα 是一种核心钟蛋白，它在维持机体免疫功能中发挥重要作用。小胶质细胞是中枢神经系统中的一种巨噬细胞，它在神经炎症中发挥重要作用，而神经炎症与抑郁症等许多神经和精神疾病密切相关。然而，REV-ERBα在神经炎症中的作用，及其分子机制目前并不清楚。我们用 REV-ERBα 的激动剂 GSK4112 来激活REV-ERBα，从而研究REV-ERBα在神经炎症中的作用。　　方法：　　我们使用小胶质细胞系、原代小胶质细胞和动物模型去研究 REV-ERBα激动剂GSK4112在体外和体内对小胶质细胞的作用。BV2细胞是一种小鼠来源的小胶质细胞系，先用GSK4112预处理BV2细胞，再用脂多糖（LPS）激活。原代小胶质细胞从新生小鼠皮层提取并准备，处理方法同BV2细胞。GSK4112和LPS通过立体定位装置注射进小鼠中脑。MTT实验用来检测细胞活力。免疫印迹和qRT-PCR实验检测相关基因的表达。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 BV2 细胞上清中细胞因子的水平。免疫荧光实验用于检测小胶质细胞和神经元活性，以及p65的分布。核质分离实验用于检测p65的核转位。荧光素酶报告基因实验用于检测GSK4112对基因转录活性的影响。　　结果：　　体内和体外实验均证明，REV-ERBα 活性升高能消除 LPS 诱导的小胶质细胞激活。GSK4112预处理BV2细胞能够显著阻断LPS诱导的炎症蛋白的表达以及白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的释放。GSK4112预处理原代小胶质细胞同样能抑制LPS诱导的炎症反应。微定量注射GSK4112到小鼠中脑，能显著减弱LPS诱导的小胶质细胞激活。GSK4112抑制了LPS诱导的NF-κB 亚基p65的磷酸化与入核，从而抑制小胶质细胞激活。而且，体内和体外实验都证明了，GSK4112 介导的神经炎症抑制保护了神经元免受小胶质细胞诱导的毒性损伤。我们的研究表明，增强的REV-ERBα活性能够抑制小胶质细胞的激活，起到保护神经元的效果。　　结论：　　我们的研究表明，药物激活REV-ERBα能够通过NF-κB信号通路抑制LPS诱导的小胶质细胞激活。此外，药物激活REV-ERBα保护了神经元免受LPS介导的损伤，起到了抑制神经炎症的作用。研究结果为临床治疗神经炎症提供了一定的理论和实验依据。