论文部分内容阅读
本文用PCR方法克隆得到EGFP基因，通过酶切、连接、转化的方法构建了pSecTag-EGFP分泌型真核表达载体，用以研究pSecTag/HygroB真核表达载体转染鸡胚胎成纤维细胞的转染效率。设计优化试验，通过脂质体介导的方法转染鸡胚胎成纤维细胞，结果24h、48h后在荧光显微镜下能直接观察绿色荧光蛋白基因的表达。用Bradford检测法检测正交优化不同组合细胞培养液中所表达分泌的增强绿色荧光蛋白的相对含量。结果脂质体介导的方法能有效转染鸡胚胎成纤维细胞，利用SAS软件分析表明：蛋白表达相对含量与质粒的多少呈极显著正相关(P＜0.01)，而与脂质体的量无显著相关性。本文运用RT-PCR技术，克隆含信号肽和不含信号肽的小鼠分泌型白血病抑制因子cDNA，通过pBS-T载体和pMDl8-T simple载体过渡，分别构建了含mLIF信号肽真核表达载体pSecTag-mlif(sp+)和不含mLIF信号肽真核表达载体pSecTag-mlif(sp-)，酶切进行初步鉴定。利用Blast程序，搜索NCBI GenBank中与构建表达载体中编码mLIFcDNA的同源序列，除在编码区216bp处碱基为G和在318bp处由G突变为T外，编码mLIF基因的其余序列与已发表的完全一致。运用DNAMAN软件对翻译水平进行预测，结果发现这一突变位点并不影响蛋白的翻译。