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黄萎病是由大丽轮枝菌侵染引起的茄子主要病害,我国大部分茄子产区均遭受黄萎病的影响,选育和种植抗病品种是控制黄萎病最为经济有效的措施。
本研究从大丽轮枝菌诱导的抗病野生茄子托鲁巴姆基因差异表达cDNA文库中挑选5型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基因StPP5和非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7的TDFs作为研究对象,采用同源克隆法扩增这两个基因,通过遗传转化获得两个转基因的烟草植株,进一步对转基因植株黄萎病的抗性进行初步分析。主要研究结果如下:
1)采用RT-PCR方法克隆了茄子5型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶StPP5的cDNA序列,该基因序列含有一个1458 bp的开放阅读框,编码由485个氨基酸构成的蛋白,分子量为54.63 kDa,理论等电点为5.66.将该cDNA全长序列提交NCBI,登录号为JF421125。StPP5蛋白N端具有 TPR家族结构域,C端具有PP2C型蛋白所特有的结构域。表达分析显示StPP5有较高的基础表达,水杨酸与大丽轮枝菌侵染增加其表达,在24 h叶中表达量达到最高,之后随时间推移而降为本底水平。
2)采用 RT-PCR方法克隆了茄子非特异性脂质转移蛋白基因StLTPα7的cDNA序列,该序列含有一个345 bp的开放阅读框,推测编码为114个氨基酸的蛋白,相对分子量为11.42 KD,理论等电点为9.01.将该cDNA全长序列提交NCBI,登录号为JF421126。StLTPa7蛋白含有AAI-LTASS家族结构域,为nsLTP1所特有的蛋白家族。表达分析显示StLTPα7在未处理的野生茄子茎和叶子中表达量极低,几乎不表达。大丽轮枝菌处理后,StLTPα7在茎中表达量随着处理时间的增加而增加,在24 h表达量达到最高,随后逐步下降为本底水平,该基因主要在叶中表达。
3)以pCAMBIA1304为载体,构建了StPP5和StLTPα7两个基因的过表达载体pCAMBIA1304-StPP5和pCAMBIA1304-StLTPα7。通过农杆菌浸染法转化烟草,经PCR检测分别获得了StPP5转基因烟草植株和StLTPα7转基因烟草植株各4株。将大丽轮枝菌在含转基因株系烟草叶片蛋白提取物的培养基上培养,结果显示StPP5转基因烟草株系P6的平均抑菌率为72%,而StLTPα7转基因烟草株系L5的平均抑菌率为78%。这些结果表明,StPP5和StLTPα7两个基因对大丽轮枝菌的生长有抑制作用。