共振光散射在核酸及生物分析中的应用

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自从1953年沃生和克里克提出了著名的DNA双螺旋结构模型后,核酸的研究进入一个飞速的发展时期,如DNA重组技术等已被人们广泛的关注,这些技术的突破大大的推动了其他学科的发展。核酸定量分析在生命科学、生化药物、临床医学以及食品检验中有着重要的作用。目前有很多种测定核酸含量的方法,如使用较广的探针技术法、吸光光度法、荧光光度法、化学发光法以及新发展起来的共振光散射法(Resonance light scattering,RLS)。共振光散射技术是一种建立在普通荧光分光光度计上的一种光散射分析技术。该技术方法操作简单、灵敏度高,在分析化学领域被广泛的应用于核酸,蛋白质,药物及糖类的分析测定。本文利用共振光散射研究了双苯甲亚胺与核酸的作用机理。结合双苯甲亚胺的荧光性质,使用散射/荧光比率法技术,建立了较稳定的核酸分析方法。具体研究内容包括以下几个方面:(1)Hoechst33258又名双苯甲亚胺是双苯并咪唑类物质的一种衍生物,是一种多环芳香族小分子物质,具有一定的电化学性,能够特异性的与DNA相互作用,可作为DNA的电化学杂交指示剂。用共振光散射(RLs)光谱来证实双苯甲亚胺与DNA之间存在静电相互作用,此外,通过吸收光谱证实了双苯甲亚胺与DNA之间的相互作用是嵌入作用;且双苯甲亚胺与DNA的主要作用在A-T区域。(2)荧光分光光度法和共振光散射法通常都只采用一种信号。对于有散射光信号与荧光信号共存的体系,我们希望能够充分利用两种信号,提高检测灵敏度和检测范围,同时能够更好的抵抗外界干扰。因此,对于同时具有散射和荧光信号的生物微粒,可以通过测定一定波长下不同的光学信号的比值,建立散射荧光比率分析法。本文基于脱氧核糖核酸(DNA)对有机染料双苯甲亚胺(Hoechst33258)的共振光散射增强效应和荧光淬灭效应,建立了一种测定DNA的散射/荧光比率法。在pH4.56时,Hoechst33258在352nm处的散射增强和500nm处的荧光猝灭的比值与鱼精子DNA(fsDNA)的浓度呈线性关系,线性范围为0.04~1.6μg ml-1,相关系数为0.9935,检出限为5ng ml-1(3σ)。该方法简便、快速,在一定范围染料浓度及外来干扰影响小,成功用于合成样品中DNA的测定。(3)流式细胞术(Flow Cytometry)是70年代发展起来的一种利用散射和荧光对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观多参数相关检测分析的新技术。另一方面,纳米药物具有许多优点,如稳定性好、对胃肠刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、具有靶向性和缓释功能等。本文研究了BSA纳米粒子与CTC作用后的药物缓释作用的研究。当单独将BSA纳米粒子与金霉素简单混合而不是在一起共同搅拌24小时的条件下,在6小时的作用下细胞受损和死亡百分率要明显高于BSA纳米粒子与金霉素共同搅拌24小时的情况,说明BSA纳米粒子为载体对于CTC的释放确实表现出缓释效应。
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