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第一部分胞内外实验验证PML-C与CNPY2蛋白间的相互作用目的：酵母双杂交实验和免疫共沉淀实验验证PML-C结构域与CNPY2蛋白有相互作用。方法：pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C共转化AH109酵母菌，酵母双杂交实验去验证PML-C结构域和CNPY2蛋白在活细胞内有相互作用；构建质粒PCMV-HA-PML-C和PCMV-MYC-CNPY2，然后共转染HEK293细胞，免疫共沉淀实验去验证PML-C结构域与CNPY2蛋白在胞外也有相互作用。结果：pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C共转化入AH109酵母菌后，在平板上蓝色的阳性克隆生长； PCMV-HA-PML-C和PCMV-MYC-CNPY2共转染HEK293细胞，48h后提取总蛋白，先后加入抗HA的多克隆抗体与PML-C反应，抗MYC的单克隆抗体与CNPY2蛋白反应，显影后观察到CNPY2的蛋白条带。结论：两种实验验证了PML-C和CNPY2蛋白有相互作用。第二部分胞外验证mut-PML与CNPY2蛋白作用目的：胞外实验去验证mut-PML与CNPY2有互作用。方法： PCMV-HA-mut-PML与PCMV-MYC-CNPY2共转染HEK293细胞后，免疫共沉淀实验验证mut-PML和CNPY2蛋白有相互作用。结果：PCMV-HA-mut-PML与PCMV-MYC-CNPY2共转染HEK细胞后，抗HA多克隆抗体沉淀蛋白复合体，抗Myc的单克隆的抗体与CNPY2蛋白结合，验证两者的相互作用结论：mut-PML与CNPY2蛋白相互作用存在。第三部分CNPY2表达下降对NB4细胞的增殖与凋亡的影响目的：研究CNPY2基因的表达减少后，NB4细胞的增殖与凋亡的变化。方法：由公司设计并合成靶向CNPY2基因的四个shRNA和一个阴性对照，分别克隆入pGpu6/GFP/NEO载体，构成重组质粒,预实验筛选出能有效抑制NB4细胞中cnpy2的mRNA和蛋白质的水平的重组质粒，分别将重组质粒pGpu6/GFP/Neo-cnpy2-shRNA、阴性对照质粒pGpu6/GFP/Neo-NC和pGpu6/GFP/Neo空载体转染NB4细胞，经过G418筛选，在下调CNPY2后，用RT-PCR、Western Blotting、MTT、流式细胞术分别检测CNPY2的转录水平、CNPY2的翻译水平、NB4细胞增殖水平、NB4细胞周期等变化。结果：G418成功筛选了重组质粒，与对照组比较，转染pGpu6/GFP/Neo-CNPY2-shRNA质粒的NB4细胞，RT-PCR结果显示CNPY2转录下降，Western Blotting结果显示CNPY2表达减少，MTT法结果显示NB4细胞的增殖的水平减慢明显，有统计学的意义（P＜0.05），流式细胞术的结果显示NB4细胞周期被阻滞在S期，有统计学意义（P<0.5），AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测结果显示，NB4细胞的凋亡率升高明显，有统计学意义（P<0.5）。结论：重组质粒pGpu6/GFP/Neo-cnpy2-shRNA抑制了CNPY2表达，引起NB4细胞增殖减慢和凋亡明显增加。