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目的RhoC(Ras homology C)是小分子G蛋白超家族中的Rho亚族的成员之一,是一种在活性的GTP形式和非活性的GDP形式之间循环的GTP酶,参与细胞的信号传导,肌动蛋白细胞骨架的调节等。近年的研究显示RhoC的过度表达能促进肿瘤细胞的侵袭转移。RhoGDIβ、RhoGDIγ被认为是RhoC的负性调节因子,它们与GDP形式的RhoC结合,使其滞留于胞浆中,阻止其与膜上的GTP结合,从而抑制RhoC的活性,在一些研究中发现RhoGDIβ与肿瘤转移和侵袭相关;关于RhoGDIγ研究目前较少。RhoC与RhoGDIβ、RhoGDIγ在肺癌组织及细胞系中如何表达及与临床病理特征间的关系,RhoC的异常表达与RhoGDIβ、RhoGDIγ间的调控关系尚不清楚。本研究对RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ在肺鳞癌、腺癌及肺癌细胞系中的表达情况,它们与临床病理因素间的关系进行了分析,探讨RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ在肺癌发生中的作用。材料与方法1、材料与试剂人肺巨细胞癌细胞系BE1(高侵袭能力亚型)、LH7(低侵袭能力亚型),人肺腺癌细胞系A549均由北京大学医学院惠赠,本实验室冻存,人支气管上皮细胞HBE购自中南大学湘雅中心实验室。40例新鲜肺鳞癌、腺癌及癌旁正常肺组织标本,均来自中国医科大学第一附属医院2006～2007年行外科手术切除的肺癌患者标本。兔抗人RhoC、羊抗人RhoGDIβ、羊抗人RhoGDIγ多克隆抗体均购自SantaCruz公司。Trizol总RNA提取试剂购自天根(Tiangen)公司,逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)公司。2、试验方法(1)Western Blot:提取组织蛋白,采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取等量蛋白,进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳和转印,一抗(anti-RhoC1:100稀释,anti-RhoGDIα1:200稀释,anti-β-actinl:500稀释)和辣根过氧化物酶标记二抗(1:1500稀释)孵育,DAB显色。以β-actin为内对照,结果判定为PVDF膜上出现灰黄色条带,并对条带进行灰度值测定。(2)RT-PCR:TRNzol试剂提取总RNA后,逆转录获得cDNA,均按说明书操作。PCR扩增产物使用1.5%琼脂糖,120V电泳30min,溴化乙啶(EB)染色,凝胶成像系统下观察。(3)应用SPSS13.0统计软件分析数据,P＜0.05为有统计学意义。结果1、RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ蛋白在肺癌细胞系中表达RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ蛋白在三种肺癌细胞系及人支气管上皮细胞系中均有表达,但三种肺癌细胞系中RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ表达均明显高于人支气管上皮细胞。高侵袭能力肺巨细胞癌细胞BE1的RhoC、RhoGDIγ蛋白表达量明显高于低侵袭能力肺巨细胞癌细胞LH7。RhoGDIβ蛋白表达在低侵袭能力肺巨细胞癌细胞LH7高于高侵袭能力肺巨细胞癌细胞BE1。但三者在人肺腺癌细胞系A549和高侵袭能力肺巨细胞癌细胞BE1中并没有区别。2、RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγm R N A在肺癌细胞系中表达RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγmRNA在三种肺癌细胞系及人支气管上皮细胞系中均有表达,但三种肺癌细胞系中RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ表达均明显高于人支气管上皮细胞。高侵袭能力肺巨细胞癌细胞BE1的RhoC、RhoGDIγmRNA表达量明显高于低侵袭能力肺巨细胞癌细胞LH7。RhoGDIβmRNA表达在低侵袭能力肺巨细胞癌细胞LH7高于高侵袭能力肺巨细胞癌细胞BE1。3、RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ蛋白在肺癌组织中表达RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ在肺鳞癌、腺癌和癌旁组织中均有表达,但在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。有淋巴结转移的肺癌病人RhoC、RhoGDIγ蛋白表达高于没有淋巴结转移的肺癌病人。与其相反,没有淋巴结转移的肺癌病人RhoGDIβ蛋白表达较高。4、RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγm R N A在肺癌组织中表达对30例新鲜肺鳞癌、腺癌组织及相应癌旁组织mRNA进行RT-PER检测,结果显示:RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ在肺鳞癌、腺癌和癌旁组织中均有表达,但在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。5、RhoC和RhoGDIβ、RhoGDI蛋白表达的相关性用Western Blot检测的肺癌组织和肺癌细胞系的灰度值做Person相关分析,发现RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ三者蛋白无明显相关性。结论1、RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ蛋白在肺鳞癌、腺癌中的表达明显高于正常肺组织,RhoC、RhoGDIγ和淋巴结转移正相关,RhoGDIβ和淋巴结转移负相关。2、RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγmRNA在肺鳞癌、腺癌中的表达明显高于正常肺组织,RhoC、RhoGDIγ和淋巴结转移正相关,RhoGDIβ和淋巴结转移负相关。3、RhoC、RhoGDIγ蛋白表达在高侵袭能力肺巨细胞癌细胞BE1较高。RhoGDIβ蛋白表达在低侵袭能力肺巨细胞癌细胞LH7较高。4、RhoC、RhoGDIγmRNA表达在高侵袭能力肺巨细胞癌细胞BE1较高。RhoGDIβmRNA表达在低侵袭能力肺巨细胞癌细胞LH7较高。5、RhoC、RhoGDIβ、RhoGDIγ三者蛋白表达无明显相关性。