pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2质粒对大鼠牙囊细胞增殖影响的初步研究

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目的:体外培养并鉴定SD大鼠牙囊细胞,构建pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2两种真核表达载体,脂质体介导pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2转染SD大鼠牙囊细胞,并检测两者对细胞增殖的早期影响,促进两种生长因子在牙周组织工程中的进一步应用。方法:1. SD大鼠牙囊细胞的体外纯化培养及组织学来源鉴定,取第四代牙囊细胞进行后期转染。2.设计Igf1和Bmp2基因的引物,PCR技术扩增两种基因片段,并构建pMD-19T/Igf1和pMD-19T/Bmp2载体。3.对pMD-19T/Igf1与pEGFP-N1质粒及pMD-19T/Bmp2与pEGFP-N1质粒进行酶切,使酶切后的Igf1,Bmp2基因分别与pEGFP-N1空质粒连接并鉴定连接后的质粒。4.取第四代牙囊细胞进行分组实验,共5组:①空白对照组、②脂质体组、③pEGFP-N1/Igf1质粒+脂质体组、④pEGFP-N1/Bmp2质粒+脂质体组、⑤pEGFP-N1/Igf1质粒+pEGFP-N1/Bmp2质粒+脂质体组。5.绿色荧光观察:转染后第二天开始观察,每天一次,持续4d。6. MTT法检测细胞活力:转染后第二天1开始检测各组细胞的活力,每天一次,持续4d。7.考马斯亮蓝(Bradford)染色法检测细胞内总蛋白浓度:配制Bradford蛋白测定工作液,分光光度计测定每组细胞的吸光值,计算出蛋白质浓度。结果:1.体外成功培养SD大鼠牙囊细胞并传代纯化,第四代细胞活力较佳。2.成功构建真核表达载体pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2。3.镜下观察荧光表达:转染后第2d最强。4.检测细胞增殖活力:转染后第1d、3d、4d均为④组>⑤组>③组>①组>②组,④⑤组间差异无统计学意义(p>0.05),其余组间差异有统计学意义(p<0.05)。转染后第2d为⑤组>④组>③组>①组>②组,④⑤组间差异无统计学意义(p>0.05),其余组间差异有统计学意义(p<0.05)。5.细胞内蛋白浓度:结果与MTT法测量结果基本一致,③④⑤组蛋白浓度明显高于其他三组,④⑤组间差异无统计学意义(p>0.05)。除②组外各组蛋白浓度从转染后第2d开始上升,第3d显著升高,第4d略有下调。结论:1.成功构建Igf1与Bmp2两种基因的真核表达载体:pEGFP-N1/Igf1质粒和pEGFP-N1/Bmp2质粒。2.脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染48h时绿色荧光表达量最强。3.脂质体Lipofectamine2000对细胞的毒性作用较为明显。4.pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2质粒早期对细胞增殖均有促进作用,但两者同时作用时相对于单独的pEGFP-N1/Bmp2质粒并无显著优势,其相互作用仍需进一步实验研究。
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