论文部分内容阅读
目的:缺血性脑卒中损伤后,激活机体免疫系统,浸润至中枢的免疫细胞及其介导的免疫炎症反应贯穿了缺血性脑损伤发生发展的全过程。尽管传统的体外实验手段可以分析卒中后免疫细胞的表型和功能变化,但目前仍缺乏有效的方法可以在活体内实时观察脑卒中后免疫细胞的生物学分布及其动态特征。本研究使用结合荧光染料的新型铁氧化物纳米微粒(SPIO-Molday ION Rhodamine-B,MIRB),追踪探索以CD4~+T细胞为代表的淋巴细胞在活体脑缺血动物中的组织分布及动态变化。方法:应用免疫磁珠方法分选C57BL/6小鼠脾脏的脾细胞,得到较高浓度的CD4~+T细胞,再经过流式细胞术高速分选得到含量较高的CD4~+T细胞。分选的CD4~+T细胞与MIRB(浓度为12.5μg/ml)在RPMI培养基中混匀,放于5%CO2、37℃敷箱中体外孵育24小时。在体外用MIRB标记后,通过流式细胞术检测上述方法获得的CD4+Rh-B+T细胞或CD4~+T细胞确定有或无标记MIRB的CD4~+T细胞的纯度,之后静脉转输至Rag2-/-转基因小鼠(无T、B细胞)体内。大脑中动脉缺血(MCAO)60分钟再灌注后的第1,3,7天,应用7 Tesla核磁共振(7T-MRI)结合Xenogen IVIS200活体成像仪,实时观察MCAO小鼠脑内及外周脏器(脾脏、肝脏)CD4~+T细胞浸润特点及动态改变,同时通过免疫荧光染色验证脑、脾脏及肝脏组中的观察结果。结果:MRI的T2*-W扫描显示MCAO模型再灌注后24小时内即可观察到MIRB标记的CD4~+T细胞在梗死灶内及梗死区周围聚集,于第3天达到峰值(P<0.01),继而MIRB信号强度减弱直至第7天。Xenogen生物发光成像显示MCAO再灌注后24小时检测出罗丹明B荧光信号,且荧光信号强度变化与MRI结果一致。在外周脏器,脾脏MIRB信号在转输MIRB-CD4~+T细胞3小时内即可检测到,MCAO 24小时后信号开始减弱,至第7天恢复至基线水平。肝脏MIRB信号在MCAO不同时间点没有看见明显变化。记录活体成像后,在不同时间点取相应组织进行免疫荧光染色,结果与体内观察结果相符。脑组织切片免疫荧光显示MCAO模型再灌注后24小时内可观察到MIRB标记的CD4~+T细胞在梗死灶内及梗死区周围聚集,于第3天达到峰值(P<0.01),继而MIRB信号强度减弱直至第7天。结论:MIRB纳米微粒结合核磁共振/生物活体成像技术是体内实时追踪脑缺血后免疫细胞动态的有效手段。该方法将为研究脑卒中和其他中枢神经系统炎性疾病发病过程中,特定炎性浸润细胞在脑内的时空特征和动态分布提供有效的技术手段。