胰腺癌是目前预后最差的恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈上升趋势。胰腺癌早期症状不典型,缺乏简单、方便的检查手段,特别是缺乏特异性肿瘤标记物,是造成胰腺癌早期诊断困难的重要原因。随着肿瘤分子生物学研究的不断深入,基因诊断有望给胰腺癌的早期诊断带来突破。近年来研究从胰腺穿刺活检组织、胰液、十二指肠液和粪便等标本中检测到频繁的K-ras基因突变,为胰腺癌的早期诊断提供了可能。但基因突变检测方法限于传统的基因表达、序列测定、突变和多态性分析等,只适用于少数样品的测定,操作步骤多且费力,不便于自动化。因此,本研究设计采用肽核酸(PNA)钳制PCR实时定量技术检测胰腺癌K-ras基因点突变,旨在探讨K-ras、基因突变检测对胰腺癌早期诊断的价值,建立适合临床应用的高效、简便、快捷的胰腺癌诊断方法。我们设计并合成了针对K-ras基因第12、13密码子的肽核酸,在实时定量检测中,肽核酸对野生型基因具有抑制作用。通过反复实验,建立该方法并进行条件优化,包括DNA模板需要量、PNA加入量及反应时间、反应条件等。并通过测序方法验证了该方法的准确性。同时,使用优化后的方法对122例临床血液标本DNA进行检测。其中67例胰腺癌标本中,突变率为59.7%(34/67);慢性胰腺炎共22例,突变率为13.6%(3/22);33例健康志愿者标本无一例突变。实验结果证明,该方法简便,可同时检测数十个样本;敏感性高,可检出的最小模板量为103拷贝,可检出的突变/野生比例在103/108以上。该方法适用于辅助临床进行胰腺癌早期诊断及胰腺癌高危人群的筛查。