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植物的花色花斑直接影响植物的观赏价值,目前,对花青素生物合成途径的研究已较为清楚,但对花斑形成分子机理的认知并不深刻,因此,研究花斑形成的分子机理对揭示花色素细微调控表达具有重要意义。蝴蝶兰(Phalaenopsis aphordite Rchb.F.)为兰科蝴蝶兰属植物,它形态优美,生境特殊,花色艳丽多彩,是目前国内外销售量最高的兰花品种之一,其中’熊猫’品种蝴蝶兰花瓣和花萼基部大块色斑模式而更具独特性,是研究单子叶植物花斑形成的好材料。本研究以白底紫斑‘熊猫’品种蝴蝶兰为研究对象,首先通过对花瓣解剖结构的观察、花色素含量测定初步分析’熊猫’蝴蝶兰花斑形成的原理;结合花萼色斑区和非色斑区转录组以及小RNA测序数据,对花青素代谢结构基因及调节基因表达差异性进行荧光定量PCR检测;基于花色素代谢结构基因PeANS,PeCHI,PeF3’H,PeF3H,Pe4CL2及转录因子 PeMYB11,PeMYB7表达差异性研究,进一步对关键调节基因PeMYB11,PeMYB7进行功能验证,为揭示‘熊猫’蝴蝶兰花斑形成结构基因与转录因子、小RNA的互作网络奠定基础,为完善蝴蝶兰花斑形成分子机理奠定实验基础。具体研究结果如下:(1)蝴蝶兰色斑区和非色斑区表皮形态一致,上表皮细胞呈圆锥形排列,下表皮细胞呈扁圆状;色斑区色素集中分布在上表皮细胞中,蝴蝶兰花色素的含量采用PH示差法测定:’熊猫’蝴蝶兰花青素含量约为1.019mg/g,而非色斑区无花色素分布,表明蝴蝶兰花斑形成是由花色素局部大量积累造成;(2)通过转录组测序获得’熊猫’蝴蝶兰花萼组织色斑区与非色斑区花青素代谢途径差异结构基因12个;并获得24条MYB基因序列,42条bHLH基因序列,22条WD40基因序列,将各类转录因子unigene序列分别与水稻响应转录因子进行多序列比对同源性分析,对候选基因功能进行初步预测;(3)通过小RNA测序获得‘熊猫’蝴蝶兰花青素代谢途径差异miRNA仅有2个;并获得12个作用于靶MYB转录因子的小RNA,4个作用于靶bHLH转录因子的小RNA,2个作用于靶WD40转录因子的小RNA;(4)利用实时荧光定量PCR分析筛选花斑形成关键基因,定量分析结果表明关键结构基因PeANS,PeCHI,PeF3’H,PeF3H,Pe4CL2,及关键转录因子PeMYB11,PeMYB7在色斑区的表达量均高于非色斑区且表达差异达到显著水平;(5)构建PeMYB7-PTRV2,PeMYB11-PTR V2病毒载体,利用VIGS技术获得’熊猫’蝴蝶兰、’紫罗兰’矮牵牛PeMYB7,PeMYB11沉默植株,发现沉默PeMYB7,PeMYB11蝴蝶兰花朵颜色均无变化;单独沉默PeMYB7,PeMYB1 在部分矮牵牛中出现白色小斑点,共沉默PeMYB7,PeMYB11后,部分矮牵牛植株中出现白色条纹,表明关键调节基因PeMYB7,PeMYB1 与蝴蝶兰花色素生物合成有关,而与花斑形成关系有待进一步实验验证。