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脂肪酶是重要的工业用酶,已被广泛应用于食品、洗涤、制药等行业。由于低温脂肪酶在低温下具有高催化活性且对热敏感等特点,使其在生物工程领域及节约能源方面有着广泛的应用前景。低温脂肪酶一般是由低温微生物产生的,因而对于产低温脂肪酶菌株的筛选是解决低温脂肪酶来源的首要且基础的问题。冻土被称为低温微生物的资源宝库,因此从天山冻土中分离、纯化低温微生物对于筛选出优质、高活力的产低温酶菌株意义重大。本研究依托新疆独特的地理环境,通过纯培养方法分离冻土低温微生物并测序研究其系统多样性,并采用宏基因组学技术建立天山冻土微生物文库。从纯培养分离的低温微生物中筛选、纯化产低温脂肪酶菌株以解决低温脂肪酶的酶源问题,对所筛选的脂肪酶菌株鉴定并分析系统发育多样性,为低温脂肪酶工程菌的构建和工业化应用奠定了一定的理论和实践基础。本研究主要得出以下结论：1通过稀释平板法共分离得到76株可培养物,(65.2)%主要为革兰氏阳性菌,且多数能产色素(68.4)%,菌落颜色呈桃红、柠檬黄、乳白等,分离得到的低温微生物最适生长温度为20-24℃,绝大多数属于耐冷菌。经16SrDNA序列测定后,选取38株代表性菌株进行系统发育分析,这些低温可培养菌株在发育树上分属于α变形细菌亚纲(Alphaproteobacteria)、β变形细菌亚纲(Betaproteobacteria)、β变形细菌亚纲(Gammaproteobacteria)、高G+C革兰氏阳性菌(Actinobacteria)、低G+C革兰氏阳性菌(Firmicute)、C F B (Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides)6个系统发育类群,其中α-β-,γ-proteobacteria为优势菌群。假单胞菌属(Pseudomonas spp.)是优势菌属占总菌数比重最大,对冻土中产低可培养低温微生物多样性贡献最多,其次是红球菌(Rhodococcus)和短波单胞菌(Brevundimonas)。本研究表明天山冻土是菌种保藏的天然产所,其可培养低温微生物具有丰富的多样性。2采用宏基因组学技术构建天山冻土低温微生物文库,阳性克隆体经菌液PCR验证、双酶切检测基因测序后得到367条序列,其中α变形细菌亚纲(Alphaproteobacteria)共有95条、p变形细菌亚纲(Betaproteobacteria)25条、Y变形细菌亚纲(Gammaproteobacteria)85条、高G+C革兰氏阳性菌(Actinobacteria) 102条、低G+C革兰氏阳性菌(Firmicute)15条、CFB (Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides)45条。文库中变形菌门是最大的进化簇,且a变形细菌亚纲(Alphaproteobacteria)、γ变形细菌亚纲(Gammaproteobacteria)所占比重较大,分别为25.9%和23.1%,放线菌门居其次,分为高G+C革兰氏阳性菌(Actinobacteria)和低G+C革兰氏阳性菌(Firmicute),其中高G+C革兰氏阳性菌亚纲是最大的一个亚纲占总序列数的27.8%。CFB(Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides)进化簇的16SrDNA序列有45条,占总数的12.3%,是基因文库中最小的发育谱系。研究表明分子学方法较人工培养获得了更多的遗传信息,多样性更丰富,并能更准确地体现天山冻土中低温微生物的分布现状。3本研究通过对大量冻土微生物的筛选,共获得17株产低温脂肪酶菌株,均能利用底物Tween-80短碳链脂肪酶和酯酶而其中8株能利用橄榄油产生长碳链脂肪酶。所得产酶菌株最适生长温度大多数为24℃左右(室温下),生长温度范围基本处于4-37℃,属耐冷菌范畴且大多数属于微好盐细菌。17株产低温脂肪酶菌株分别属于α变形细菌亚纲(Alphaproteobacteria)、β变形细菌亚纲(Betaproteobacteria)、γ变形细菌亚纲(Gammaproteobacteria)、高G+C革兰氏阳性菌(Actinobacteria)、CFB (Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides)5个系统发育类群,其中高G+C革兰氏阳性菌(Actinobacteria)中的菌属最多单胞菌属(Pseudomonas spp.)为优势菌属所占比重最大,对冻土中产低温脂肪酶多样性贡献最多,其次是金黄杆菌(Chryseobacterium)、红球菌(Rhodococcus)和短波单胞菌(Brevundimonas)。因此,天山冻土中蕴藏着极其丰富多样的产低温脂肪酶微生物资源,是理想的酶源。