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研究背景血管内皮细胞糖萼（Glycocalyx）是位于内皮细胞顶端的一层绒毛状多糖蛋白复合结构,是内皮表面的天然动态屏障。研究发现,炎症微环境下血管内皮糖萼稳态受损是促发内皮功能障碍,诱导动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）等血管损伤性疾病进程的关键始动因素,但其损伤机制研究并不全面,由此限制了靶向药物开发。川芎嗪（Tetramethylpyrazine,TMP）是一种广泛应用于临床,治疗心血管疾病的中草药单体。已有研究揭示,TMP通过减轻血管内皮损伤发挥作用,但其是否通过调控血管内皮糖萼稳态发挥作用尚不清楚。因此,本研究将采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）体内外诱导内皮构建炎症模型,验证LPS诱发血管内皮糖萼损伤机制并探索TMP是否对炎症微环境下血管内皮糖萼具有保护作用及可能机制,为TMP的深度临床开发提供更多基础数据。研究目的验证LPS诱发血管内皮糖萼损伤机制,并探索TMP是否可改善内皮糖萼损伤并逆转血管损伤性疾病进程机制,为TMP的临床应用及深度开发提供科学依据。研究方法1)LPS诱发血管内皮糖萼损伤模型构建采用不同浓度LPS刺激血管内皮细胞,基于CCK-8方法分析LPS对内皮细胞存活率的影响,确定最佳作用时间与浓度。进一步采用免疫荧光方法检测糖萼标记物WGA水平,RT-PCR及Western blot（WB）方法检测主要组成糖萼组分HS水平及内皮炎症标记物VCAM-1表达变化,验证LPS诱发内皮糖萼损伤模型构建成功。通过单核内皮细胞黏附实验,明确LPS对单核与内皮黏附能力的影响,验证糖萼损伤是导致内皮炎症性功能障碍的重要因素。此外,采用LPS（2.5 mg/kg）腹腔注射C57BL/6小鼠,构建全身性炎症体内模型,采用免疫荧光、WB及电镜等方法分析体内炎症微环境下,主动脉弓部位血管内皮糖萼水平及内皮炎症水平,明确LPS在体内对血管内皮糖萼的损伤作用。2)探索TMP在体内、体外对血管内皮糖萼损伤的保护作用采用CCK-8实验,分析TMP对内皮细胞存活率的影响,选择对内皮增殖无抑制作用的浓度（50、200μM）进行后续实验。基于以上细胞与动物模型,通过免疫荧光检测内皮细胞糖萼标记物WGA、HS;RT-PCR、WB等方法分析TMP预处理细胞及动物后,内皮细胞糖萼组分HS、SDC-1及炎症标记物VCAM-1的表达;通过单核内皮细胞黏附实验,分析单核-内皮细胞黏附能力改变;此外,TEM技术分析小鼠主动脉弓部位血管内皮糖萼形态的改变,体内、体外明确TMP对血管内皮糖萼的保护作用。3)探究TMP改善炎症诱导血管内皮糖萼损伤的分子机制采用WB方法分析TMP对糖萼剪切酶（HPSE1）表达的影响,并构建HPSE1过表达质粒,WB方法及单核内皮细胞粘附实验验证HPSE1在调控糖萼损伤并促进内皮功能障碍中的关键作用。进一步采用分子对接方法初步分析TMP是否通过与LPS受体TLR4-MD2蛋白复合物竞争结合,并调控下游信号分子NF-κB激活来调控HPSE1表达,进而发挥糖萼保护作用,并采用WB验证信号轴蛋白的表达变化。为明确TLR4/NF-κB在调控HPSE1表达方面的作用,构建si RNA瞬时干扰TLR4内皮细胞模型,联合NF-κB抑制剂,通过WB、免疫荧光等方法明确TMP通过TLR4/NF-κB信号通路调控HPSE1表达水平,进而影响糖萼稳态。此外,收集小鼠主动脉弓部位血管组织,WB方法验证TMP对以上在体内对以上信号轴蛋白的调控作用。研究结果1)与对照组相比,LPS呈浓度与时间依赖性降低糖萼标记物WGA水平,降低糖萼组分HS水平,并上调炎症因子VCAM-1的表达水平。同时,单核内皮黏附实验表明,LPS可上调单核细胞与内皮细胞粘附。此外,小鼠腹腔给予LPS构建体内全身性炎症模型后,主动脉弓部位血管内皮WGA、HS水平降低,VCAM-1水平增加。2)与LPS模型组相比,TMP可在细胞与动物水平显著上调血管内皮WGA及HS水平,并降低VCAM-1表达,恢复细胞间通讯VECa水平并减少单核与内皮黏附能力。3)分子对接结果显示TMP可与TLR4/MD2蛋白紧密结合。通过免疫荧光、WB等分析TMP可以通过抑制TLR4/MD2/NF-κB信号轴蛋白磷酸化,降低HPSE1表达,改善血管内皮糖萼损伤。研究结论1)LPS可诱发血管内皮糖萼损伤,促进血管性炎症。2)TMP可在体内、体外改善LPS介导的血管内皮糖萼损伤,降低内皮炎症并缓解单核细胞与内皮粘附能力。3)TMP可抑制TLR4/NF-κB/HPSE1信号轴,改善炎症诱导血管内皮糖萼降解,具有治疗AS等血管损伤性疾病潜质。