论文部分内容阅读
免疫毒素是靶向抗肿瘤药物一个新的研究热点,具有良好的应用前景。传统的免疫毒素主要是通过进入细胞内部而发挥作用,在实体瘤中效果不理想,有一定的局限性。本文利用柔性链接(G4S)3将能破坏细胞膜的海葵溶细胞素Gigantoxin-4和靶向肿瘤细胞表面人表皮生长因子受体-2 (HER2/neu)的单链抗体4D5 scFv连接,制备新型的免疫毒素。将SUMO标签融合在Gigantoxin-4-4D5 scFv的N端,构建pET-28a(+)/SUMO-Gigantoxin-4-4D5 scFv重组质粒,实现了在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶表达,目的蛋白占表达上清的9.8%。通过镍柱及弱阳离子交换柱对重组蛋白进行纯化,最终得到纯度达96%的目的蛋白,1L发酵液中可以获得14.3 mg的Gigantoxin-4-4D5 scFv。MTT实验表明Gigantoxin-4-4D5 scFv对高表达HER2的卵巢癌细胞SK-OV-3和乳腺癌细胞SK-BR-3有强烈的抑制作用,IC50分别为0.171和0.158 nM,而对于HER2阴性的卵巢癌细胞OVCAR-3和正常人胚肾细胞HEK-293几乎没有影响,且Gigantoxin-4-4D5 scFv的溶血活性HC50为18.9 nM。利用激光共聚焦显微镜检测发现Gigantoxin-4-4D5 scFv能特异结合在高表达HER2的SK-OV-3细胞膜上,而对HEK-293细胞没有选择性,且4D5 scFv的加入能抑制Gigantoxin-4-4D5 scFv对SK-OV-3细胞的作用。扫描电镜及胞外乳酸脱氢酶(LDH)活性实验证明Gigantoxin-4-4D5 scFv能破坏SK-OV-3细胞膜,引起细胞坏死,对SK-BR-3细胞也有同样的作用。流式实验证明Gigantoxin-4-4D5 scFv不仅能引起SK-OV-3和SK-BR-3细胞坏死,还能诱导凋亡,而对OVCAR-3和HEK-293细胞则没有影响。体外活性实验证明Gigantoxin-4-4D5 scFv能特异地结合高表达HER2的肿瘤细胞,通过坏死和凋亡引起细胞死亡,而对正常细胞和HER2阴性的肿瘤细胞没有影响,是一个非常具有潜力的靶向高表达HER2肿瘤的免疫毒素。融合蛋白之间的链接对蛋白的结构及活性起着至关重要的作用,为了进一步得到抗肿瘤效果更好的重组蛋白,对Gigantoxin-4-4D5 scFv之间的链接从长短和刚柔两方面设计了如下六个新的链接：①(G4S)2,②(G4S)4,③PSTPPGGS,④(PKPSTPPGGS)2, ⑤GGSPKPSTPPGGGS,⑥GGS(PKPSTPP)2GGGS.采用镍柱及弱阳离子交换柱对蛋白进行纯化,MTT和溶血实验表明④号链接蛋白的溶血活性大大降低,但对SK-OV-3细胞的活性基本不变,相对于原始的蛋白抗肿瘤潜力更大。