截止2016年,中国60岁及以上人口超过2.2亿,占总人口比例超过16%,中国的老龄化现象越发严重。衰老及其相关疾病的问题受到大众的关注,如何延长寿命,如何提高生活质量显得尤为重要。首当其冲的就是衰老相关疾病的治疗,如骨质疏松、白内障、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化等等。这些衰老疾病高几率的出现严重影响了老年人的生活品质。在科技飞速发展的今天,越来越多的人们希望借助现代科技来延长寿命和提高老年生活品质。成人早老综合征(Werner Syndrome,WS)是一种极为少见的常染色体隐性遗传病,由DNA解旋酶WRN基因的突变导致。患者在青春期后会快速的衰老,且有可能患上骨质疏松、白内障、Ⅱ型糖尿病等衰老相关疾病。早老综合征的这些特性使之成为了研究衰老的绝佳模型。依据衰老表征依赖于WRN功能缺失及端粒缩短的原理,端粒酶RNA模板Terc及Wrn双基因敲除的小鼠成为了忠实再现WS早老表型的模型。由于纯合的Terc敲除,WS小鼠丧失了端粒酶的活性。随着小鼠的传代繁殖,其子代小鼠细胞的端粒逐渐缩短,衰老表征的出现也逐渐提早。Terc纯合敲除的第一代小鼠为G1代,G1与G1代繁殖得到的后代称为G2代,由此依次传代繁育获得G3、G4、G5代的WS小鼠。当小鼠繁育到G3之后,端粒长度缩短到了一定程度,与G1代和野生型小鼠(wild type,WT)相比,小鼠半数死亡时间以及最长存活时间都明显缩短,毛发变白,白内障等老年相关表型发生的时间也明显提前。这些表型为我们的衰老研究提供了很好的监测指标。Cdkn1a基因编码的p21蛋白是细胞周期抑制因子中的一种,它可以通过抑制细胞周期依赖激酶(CDKs)的活性来抑制细胞周期的进程。另外,它还能通过竞争性的结合PCNA(细胞增殖核抗原),来抑制PCNA依赖性的DNA聚合酶的作用,进而抑制DNA复制或者修复的进程。p21的缺失会导致细胞周期抑制的部分解除,在p53保持野生型的前提下,可能延缓细胞衰老而不导致肿瘤发生。因此,我们在WS模型小鼠中敲除p21,通过观察p21敲除对衰老小鼠表型的影响,来研究调控p21对延缓衰老进程的作用。我们用p21敲除小鼠与WS小鼠进行杂交,获得Terc、Wrn、p21三基因敲除的小鼠(TKO),然后迭代繁殖得到G2,G3,G4TKO的小鼠。我们惊奇地发现,p21的缺失并没有能减缓WS小鼠的衰老,反而加速了这一衰老进程。通过对比研究WT、G2WS/TKO、G4WS/TKO小鼠的生存曲线,我们发现,G4WS小鼠的寿命有430天,而G4 TKO小鼠寿命则锐减至196天。G4 WS小鼠半数死亡天数为184天,而G4 TKO小鼠半数死亡天数则下降至133天。G2 WS与G2TKO小鼠相比则没有显著性差异。这一结果表明,随着端粒长度的缩短,p21缺失加速WS衰老的作用越加显著。对小鼠股骨的X射线检测发现,4月龄G4 TKO的小鼠与G4 WS和WT相比骨密度明显减小,表明4月龄G4 TKO小鼠已经出现了骨质疏松。进一步,我们通过SA-β-gal染色来观察小鼠睾丸与小肠组织的衰老情况,结果表明,WT、G4WS、G4TKO小鼠的睾丸和小肠细胞中SA-β-gal染色阳性比例依次升高,即衰老程度逐步上升;我们用免疫组化、BrdU掺入实验来检测小鼠睾丸和小肠的细胞增殖。结果表明,G4 TKO与G4 WS小鼠相比,其Ki67表达量及BrdU的阳性率都更高,可见G4 TKO比G4 WS有更高的细胞增殖水平;另外我们用TUNEL凋亡染色和组织Western blot实验检测其睾丸和小肠细胞的凋亡水平。结果发现,G4 TKO小鼠组织的凋亡染色阳性水平远高于G4WS小鼠组织,而G4 TKO小鼠组织中Bax的表达量也更高,表明G4 TKO小鼠组织的细胞凋亡水平要高于G4 WS小鼠;而后通过免疫荧光技术检测了小鼠睾丸和小肠的DNA损伤标志蛋白γ-H2AX的表达,结果发现,G4 TKO小鼠比G4 WS、WT小鼠细胞都有更高的阳性比例,表明G4 TKO的小鼠MEFs细胞的DNA损伤程度也高于WS小鼠;我们还通过流式技术来检测细胞周期的变化,发现G4 TKO小鼠MEFs细胞的G2/M期阻滞明显增强。这些结果提示,p21功能缺失导致G1/S期检验点的功能大幅削弱,携带DNA损伤的细胞通过G1/S期,在G2/M期发生阻滞。综上所述,我们在小鼠整体水平及细胞水平的研究,p21的功能缺失确实加速了 WS小鼠组织细胞及个体的衰老。由于p21基因是G1/S期检查点的重要调控因子,我们大胆推测:由于p21的缺失,G1/S期检查点检查DNA完整性的功能减弱,使得细胞无法在G1/S期检验点实现阻滞。损伤细胞顺利进入细胞周期,导致细胞损伤大量累积。损伤的累积导致p53介导的损伤应激通路激活,但无法完成损伤修复,进而诱导细胞衰老和细胞凋亡。同时,p21的功能缺失导致细胞周期大大加快,导致小鼠各个器官的细胞过度增殖,过度消耗了用于组织更新的干细胞库,表现为小肠、睾丸的衰竭。这些研究结果提示我们,单纯地通过去除细胞周期抑制机制,如p21的功能,来逆转衰老进程未必可行。尤其是在细胞的端粒DNA已经损伤的情况下,去除细胞周期抑制可能加速损伤细胞的增殖,放大DNA损伤效应,反而会加速衰老的进程。也许我们可以从帮助DNA损伤修复及清除衰老细胞等多方面考虑,以提出更好的解决方案。