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炭疽是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的人畜共患的重大烈性传染病。炭疽芽孢作为A类生物战剂,由于其强烈的致病力及其对环境的极强适应能力等特性,一直是生物战/生物恐怖的首选,也是重大的威胁。因此,炭疽防控是防生/反恐的重要研究目标。对于炭疽有效的治疗措施主要有二大类:一类是炭疽杆菌的抑菌剂和杀菌剂,其中包括抗菌素和噬菌体的溶菌成分;另一类是依据炭疽病理模型设计的毒素抑制剂,主要包括炭疽毒素中和抗体、可溶性受体、毒素突变体和小分子拮抗剂。对吸入性炭疽的治疗抗菌素虽然有效,但必须在感染初期立即使用,存在一定的缺陷。具有中和活性的抗体作为被动免疫制剂可以直接提供有效的保护,其因为具有保护性高,在人体内可以发挥特有的补体依赖的细胞毒(complement dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)免疫反应,半衰期长,性质稳定等优点,成为目前最有前景的炭疽毒素抑制剂。 本研究的目标是基于国内外的研究现状和研究室的基础,期望研制新型炭疽特异性治疗药物。研究内容包括首先对抗PA鼠源单抗进行人源化改造以降低鼠单抗的异源性,然后利用中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统规模化制备人源化抗体,并对纯化的人源化抗体进行体内外效力学研究。 首先应用抗体“框架区重塑”技术,对本室制备并保存的鼠源单克隆抗体(mAb)的框架区进行了人源化。通过Kabat数据库对获得的鼠源单抗进行框架区(framework region, FR)和互补决定区(complementarity determinative region, CDR)的划分。保持CDR区氨基酸不变,对FR序列进行最大同源性检索,选择与框架区同源性最高的人源序列。考虑到CDR相邻的3个氨基酸可能对构象有影响,对个别关键氨基酸进行了保留。人源化程度分别达到了95.35％和95.77％(氨基酸序列的同源性)。然后构建了带His标签的人源化单链抗体的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达了人源化单链抗体,亚细胞定位实验显示,表达产物主要以包涵体的形式存在,超声后的包涵体经洗涤、变性后经过Ni离子螯合柱纯化,ScFv纯度达90％以上。经梯度透析法复性得到了人源化的单链抗体,并在毒素作用的J774A.1细胞模型上对其生物学活性进行了初步评价,实验证明人源化单链抗体具有一定的中和活性,为进一步制备具有生物学功能的全分子人源化抗体奠定了实验基础。 本文选择利用哺乳动物细胞表达系统制备人源化全分子抗体。哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主,有很多其他体系不能与之相比的优势。用哺乳动物细胞表达产生的完整抗体和天然抗体一样,具有生物学活性,既可识别抗原又可激活补体系统。目前,美国418种在研药物中70％是由以CHO为主的哺乳动物细胞表达的。 为了获得在CHO细胞中稳定高表达的工程细胞株,我们尝试了不同的信号肽及细胞系,分别构建了四种信号肽的表达质粒包括 pMH3-EPO-HII/L、pMH3-tPA-HII/L、pMH3-ori-HII/L和pMH3-VH21-HII/L。将表达质粒分别电转染CHO-S及CHO-K1细胞,并用G418进行筛选,G418浓度为1.8mg/ml。一次克隆所得到的稳定表达的细胞株经过二次克隆筛选,最终发现pMH3-VH21-HII/LII在CHO-S细胞中的表达量较高,挑选高表达细胞株进行传代培养,最终得到可稳定传代的高表达细胞株。将得到的细胞株用无血清培养基进行悬浮培养,并逐级放大,最终在CURRENT AP200生物反应器中进行规模化制备,发酵过程中监测细胞密度、细胞活率、葡萄糖浓度、渗透压、pH值和溶氧情况等指标,优化培养条件,最终可以达到高于300mg/L的产量,反应器中的细胞产率达到7.87pg/cell/day。62L的发酵液经过离心、超滤浓缩后用Mab select sure亲和层析介质进行纯化,最终可以得到13g以上的纯品,HPLC测定抗体的纯度大于95％,得率大于60％。 表达的全分子人源化抗体在非还原SDS-PAGE中表现为一条约150kD的带,在还原SDS-PAGE中表现为一条约50kD和一条约25kD的带;Dot-Blot结果显示,此人源化抗体可以与PA的结构域2(非loop区)发生特异性免疫反应。N末端氨基酸序列测定和分子量测定显示获得预期的人源化抗体。 在获得预期的人源化抗体后,在体内外模型上进行了效力学研究。在毒素作用的J774A.1细胞模型上,人源化抗体显示良好的保护活性,EC50为0.95μg/ml。在毒素作用的Fisher344大鼠模型上,如果毒素和抗体同时给药,抗体和PA摩尔比为1:1时即可提供完全保护;抗体在毒素之后10min给药,抗体与PA摩尔比为8:1即抗体给药量为3.2mg/kg时,保护率达83.3％(5/6),而抗体在毒素之后20min和30min给药,即使抗体量达到8mg/kg和32mg/kg,依然不能使大鼠存活,但可以延长大鼠的存活时间。在芽孢感染的家兔模型上,采用攻毒菌株为国家标准株40048,攻毒剂量为80-120LD50炭疽芽孢,分别在攻毒后1小时和24小时后给予2mg/kg的人源化抗体,结果显示1小时后给药可以保护50％(3/6)的兔存活,24小时后给药可以保护33％(2/6)的兔存活。 以上实验结果表明,制备的人源化抗体能作为被动保护制剂,在炭疽的治疗上具有潜在应用价值,有望成为新型炭疽特异性治疗药物。