丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的根是我国大宗药材,广泛应用于心脑血管疾病的治疗。丹参的次生代谢产物丹参酮、隐丹参酮、迷迭香酸、丹酚酸B等是其主要的药用活性成分。植物的次生代谢产物是抵抗外界不利环境的重要物质,也是主要的药用活性成分,因此次生代谢产物的积累与其生长环境条件需求方面存在矛盾,这是药用植物种植与其药用成分开发利用的难题。已有研究表明WD40/MYB/bHLH转录因子复合体调控多个参与次生代谢酶基因的表达,以此来影响次生代谢产物的积累,其中WD40蛋白作为一个骨架蛋白,在转录因子复合体中承担着“脚手架”的作用,并且有研究报道WD40蛋白在植物的抗逆,特别是抗旱响应中发挥重要作用。本研究基于丹参全基因组数据过对丹参WD40基因家族进行筛选,找到响应干旱胁迫的基因Sm WD40-1 70,通过对该基因的调控探索其响应干旱的机制,以及对丹参生长、次生代谢产物合成和积累的影响。主要研究内容及结果如下:1.基于丹参全基因组数据库,共鉴定出225条Sm WD40基因。通过系统发育分析将所有SmWD40分成了 9个亚家族,根据其结构域被分为17个亚家族;利用生物学软件对该家族所有成员进行了生理生化分析、基因结构分析、蛋白保守基序分析以及GO注释;运用实时定量PCR技术对所有基因在丹参不同部位的表达模式进行了分析;为了进一步深入研究丹参WD40基因的功能,对基因家族成员启动子顺式作用元件进行了统计分析,对筛选出来的110条具有干旱响应元件的基因在脱水处理不同时间段进行了表达模式分析,筛选出一条显著响应的基因SmWD40-170。2.构建丹参Sm WD40-1 70基因的HBT-GFP-NOS亚细胞定位载体,分离纯化拟南芥原生质体,通过PEG介导的化学转化法将定位载体转入到拟南芥原生质体中,发现SmWD40-170定位在细胞核和细胞质中。3.借助Gateway技术和amiRNA技术分别构建了Sm WD40-170过表达和干涉载体,通过根癌农杆菌介导的丹参叶盘转化法获得了SmWD40-170的过表达植株和Sm WD40-170的干涉植株,并从DNA水平和RNA水平进行验证,选取3个过表达株系(OE-3、OE-7和OE-8)和3个干涉株系(i-11、i-14和i-15)进行后续功能研究。4.通过对ABA,H2O2处理3h后的丹参Sm WD40-170过表达株系和干涉株系气孔开度进行测量,发现干涉株系和对照株系(CK)相比气孔完全打开,不能够正常关闭。又对过表、干涉和对照株系分别进行了脱水处理,发现干涉株系的脱水速率要比对照株系快,同时测定了脱水3h后的气孔开度,干涉株系相较于对照株系不能正常关闭。由此推断,Sm WD40-170通过调节气孔运动响应干旱胁迫。5.将60d丹参过表达、干涉及对照株系的组培苗移栽到土培基质培养后发现:与对照株系相比干涉株系的叶片小、叶边缘卷曲、根系少,整个植株生长缓慢;过表达株系叶片大,根系发达,生长比较旺盛。6.检测土培60d的丹参过表达、干涉和对照株系次生代谢产物含量。(1)分析过表达、干涉及对照株系中总酚酸、总黄酮的含量,结果显示:Sm WD40-170过表达株系总酚酸和总黄酮含量与对照相比有所提高,而SmWD40-170干涉株系总酚酸和总黄酮含量与对照相比显著下降。(2)利用LC-MC检测过表达、干涉及对照株系(CK)丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮ⅡA、隐丹参酮的含量,结果显示:SmWD40-170过表达基因株系中迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量显著提高,Sm WD40-1 70干涉株系中各成分含量明显下降。(3)对转基因株系及对照株系中丹酚酸类生物合成途径及丹参酮生物合成途径中关键酶基因进行了表达模式分析。结果显示:丹酚酸类合成途径上的SmPAL、SmC4H、Sm4CL、SmTAT、SmTAT、SmRAS和SmCYP98A14等关键酶基因在过表达株系中显著上调,在干涉株系中明显下调;在丹参酮生物合成途径上的关键酶基因SmDXS,SHMGR,SmFPPS,SmGGPPS,SmCPS和SmKSL的表达量在过表达株系中显著上调,在干涉株系中显著下调。由此推断,Sm WD40-170通过调控叶片、根系的生长来影响次生代谢产物的合成与积累。综上所述,本研究为丹参WD40家族成员的鉴定奠定了生物信息学方面的基础,又为Sm WD40-1 70在抗旱、生长及次生代谢方面的研究开拓了思路。