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背景:种植体的表面形貌可调节细胞蛋白质吸附,改变细胞内信号传导,影响成骨细胞分化及最终成骨效果。微纳米复合形貌可更好地模拟天然骨结构,相比于单纯微米或纳米表面形貌,其对促进成骨细胞成熟以及间充质干细胞分化显示出更佳的效果。目前众多学者关于材料改性的研究都仅着重于其促成骨细胞的增殖分化,而忽略了种植体植入早期免疫反应的影响。种植体植入后,组织损伤导致血液外渗,血液中的蛋白质等分子会在短时间内被释放并附着在种植体表面,引起血液-材料相互作用,其中损伤相关分子的表达和释放能够激活宿主免疫应答,引起炎性细胞的浸润和激活。巨噬细胞具有高度的可塑性及动态性,受组织微环境中信号的影响可以相互转化,可转化为促炎M1型或抗炎M2型,分泌IFN-γ、TNF-α和IL-1 β等促炎因子或VEGF、TGF-β和IL-10等抗炎因子,从而对骨的愈合和再生产生有利或有害的影响,是整个骨再生微环境的中心调控者。巨噬细胞极化受到多种因素的影响,其中种植体表面形貌在调节免疫细胞应答中起到主导作用,目前众多研究多表明纳米形貌的免疫调节作用优于微米形貌,且不同的纳米形貌的免疫调节能力差异明显;而微纳米复合表面微形貌的免疫调节能力及免疫促成骨能力的研究较少。目的:本实验拟通过大颗粒喷砂酸蚀(sandblasted,large-grit,acid-etched;SLA)、碱热反应来处理光滑钛片,最终获得光滑、微米、纳米和微纳钛片。观察四种钛片M1及M2型标志因子、炎症因子的表达,以及巨噬细胞的形态变化来探究微纳米钛片的免疫调节能力;通过细胞迁移实验及共培养,观察不同钛片的免疫环境对成骨细胞的迁移、细胞基质外矿化及成骨基因表达的影响,从而探究微纳米复合形貌的骨免疫与成骨之间的作用机制,为微纳表面结构种植体促进骨整合的分子生物学机制提供理论基础,并为微纳种植体的临床治疗提供有意义的理论基础。方法:1.制备光滑(P)、微米(S)、纳米(N)和微纳(SN)钛片,采用冷场扫描电镜观察四种钛片的表面微形貌,3D激光扫面电镜测定钛片的平均表面粗糙度Ra,采用悬滴法进行亲水性测试。2.采用CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂盒-8)技术检测两种钛片表面MC3T3-E1细胞、RAW264.7细胞的增殖活性。3.采用冷场扫描电镜观察四种钛片上5、7天时RAW264.7细胞的个体形态变化。4.采用qRT-PCR检测四组钛片表面RAW264.7细胞中检测四组钛片表面RAW264.7细胞中M2型相关基因IL-10、CD206、VEGF,以及M1型相关基因TNF-α、IL-1 β、CD86 mRNA水平的表达;取不同的RAW264.7条件培养基分别刺激相应钛片培养的MC3T3-E1,刺激7天后实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测四组钛片表面MC3T3-E1细胞中BMP2、VEGF的表达水平。5.采用 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,酶联免疫吸附测定实验)技术检测四种钛片上RAW264.7培养1、3、7天时上清液中TNF-α、IL-10的表达水平。6.采用Transwell小室系统,用于MC3T3-E1细胞迁移趋化实验;不同钛片条件培养基刺激24小时后通过CCK8检测从上室迁移至下室中MC3T3-E1细胞的数量。7.取四组钛片的RAW264.7条件培养基分别刺激相应钛片培养的MC3T3-E1,7天时行茜素红染色,拍照后进行洗脱法半定量分析;在四组钛片上单纯培养MC3T3-E1细胞,14天后行茜素红染色,拍照后并进行洗脱法半定量分析。8.数据分析:对实验数据进行正态性检验及方差齐性分析,若方差齐且数据符合正态分布;对各数据组间均数采用单因素方差分析和多重t检验,其结果以均数±标准差(x±s)来表示;如数据不满足方差齐、正态分布,即采用非参数检验。本实验以P<0.05定义为有统计学意义。结果:1.机械加工的光滑钛片达到镜面效果;SLA处理后钛片呈灰白色粗糙表面,碱热反应后钛片表面隐约可见镜面基底;微纳SN钛片呈灰棕色。冷场扫描电镜及3D激光显微镜观察样品表面3D微结构与粗糙度。光滑钛片表面平整且未见明显划痕;大颗粒喷砂酸蚀后钛片表面低倍镜(10000X)可见大量凹坑,凹坑之间重叠连续。通过高倍镜以及3D微结构进一步观察可见孔径约为30-50um的一级凹陷上重叠多个孔径为3-8um的二级凹陷;碱热钛片可见相互联通的网状纳米孔结构,纳米孔孔径约为50-200nm;微纳钛片是将光滑钛片喷砂、酸蚀,之后进行碱热反应而获得,电镜及3D结构图可见在整体微坑表面上叠加了网状纳米孔结构。粗糙度测试结果显示微米和微纳钛片相对于光滑钛片,平均粗糙度由0.054增加到了 1.701、1.641(P<0.05),但微米及微纳组平均粗糙度无统计学差异;纳米钛片平均粗糙度(0.422)虽低于微米级微纳钛片,但仍显著高于光滑钛片(P<0.05)。亲水性测试结果显示与光滑及微米表面相比,微纳钛片的接触角显著降低(P<0.05)。2.在四组钛片上培养RAW264.7、MC3T3-E1细胞,分别在第1、3、5、7天进行CCK8检测,可见RAW264.7细胞四组样品增殖曲线趋势相近;MC3T3-E1细胞增殖折线图可见3天前SN、S组增殖低于P、N组,而7天组SN组细胞数量明显高于其他三组。3.四组样品表面RAW264.7细胞分别于5天、7天后终止培养,黏附形态变化电镜图可见,P组细胞整体呈圆盘状,第5、7天形态差异不大,细胞表面伪足细、短;S表面细胞形态与P组类似,细胞亦呈圆盘状,无明显伪足凸起;N组细胞主体呈星形,多边凸起状,伪足较长,向四周伸展与邻近细胞相接触;SN组细胞在5天时,细胞多呈圆盘状,伪足短不明显,第7天可见细胞多呈多边形,与N组相似,伪足长,沿表面伸展与邻近细胞接触。4.在四组钛片上培养RAW264.7细胞1、3、7天后,qRT-PCR检测四组钛片表面 RAW264.7 细胞中 CD206、CD86、IL-10、TNF-α、VEGF mRNA水平,结果如下:1、3、7天时SN组IL-10表达量均优于P、S、N组(P<0.05);1、3天时SN组CD206、VEGF 表达高于 P/S/N 组(P<0.05),而 7 天时 CD206、VEGF 表达 SN 组与纳米N组表达无统计学差异。CD86基因表达可见1天时S组表达量明显高于P、N、SN组(P<0.05),其次为SN组,高于P、N组(P<0.05);CD86基因表达在3天时S及SN表达量差异不大,无统计学意义,但两组均仍稍高于P、N组(P<0.05);CD86基因表达7天时四组表达量差距不大,与SN组相对,N组表达最低(P<0.05),P、S组表达差异无统计学意义。炎症因子TNF-α表达在1、3、7天N组最高,与N组相比SN表达相对减低(P<0.05),但两组明显高于P及S组(P<0.05);IL-1β表达1、3天时S、N组明显高于P及SN组(P<0.05);7天时S组表达最高(P<0.05),SN与N组表达无统计学差异。5.在四组钛片上培养RAW264.7巨噬细胞系1、3、7天后,ELISA检测各组上清液中IL-10、TNF-α水平结果可见IL-10分泌量在1、3、7天时微纳组均高于其他三组(P<0.05);TNF-α分泌量在1、3、7天时纳米组分泌量最高(P<0.05),微纳组和光滑组差异不大,而微米组相对较低。6.采用CCK8方法检测条件培养基诱导MC3T3-E1的迁移,Transwell 24h结果显示,SN、N组促迁移能力均优于P、S组,且SN组促MC3T3-E1迁移效果最佳(P<0.05)。7.采用实时定量PCR方法检测了不同表面形貌和条件培养基对MC3T3-E1 BMP2及VEGF表达的影响。在表面微形貌和条件培养基的共同作用下,SN组的BMP2、VEGF的基因表达高于其他三组(P<0.05)。8.采用茜素红染色剂半定量分析同表面形貌和条件培养基对MC3T3-E1细胞外基质矿化水平的影响,结果可见在条件培养基的刺激下7天后,不同表面的矿化程度均发生了明显的提高,此时SN组表面的矿化水平显著高于N、S、P组(P<0.05)。四组钛片上单纯培养MC3T3-E1细胞14天时可见N及SN组矿化水平差异较少,均明显高于P、S组(P<0.05)。共培养7天矿化结果与14天单独培养对比可见,P、S组没有明显改变,而N及SN组矿化程度显著提高,SN组更甚(P<0.05)。结论:通过大颗粒喷砂酸蚀及碱热反应获得的三维立体微纳米网状结构可以促使巨噬细胞向M2型极化,降低TNF-α、IL-1 β的表达,使局部微环境达到抗炎效果。微纳钛片的抗炎免疫环境可通过促进成骨细胞迁移、增殖以及细胞基质外矿化;还可能通过促进成骨细胞分泌BMP2、VEGF促进骨再生以及血管再生。但其涉及的信号通路及具体机制仍需进一步研究。