肿瘤的基因治疗主要分为四类：突变补偿、分子化疗、免疫增强和耐药转变。其中，属分子化疗的1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/羟甲基无环鸟苷（HSV1-TK/GCV）系统治疗恶性脑瘤疗效肯定，这一方案在国外已进入3期临床实验。也是国内到目前为止批准进入临床研究的唯一的肿瘤方案。HSV1-TK/GCV是目前最有希望进入临床治疗的基因治疗系统。其治疗原理为：HSV1-TK通过载体系统导入肿瘤细胞后，表达HSV1特有的胸腺嘧啶核苷激酶（HSV1-TK），其作用于核苷类似物羟甲基无环鸟苷（GCV），使其磷酸化为高度细胞毒性物质，抑制肿瘤细胞DNA合成，导致细胞死亡；而且对周围的肿瘤细胞有“旁观者效应”，具有强烈的肿瘤细胞杀伤效应。 GE7导入系统为顾健人实验室构建的一种靶向非病毒载体，通过表皮生长因子（EGF）受配体结合的介导作用，经胞吞作用将外源基因导入细胞内，而靶向作用于EGF受体阳性细胞，经此途径导入的外源基因的表达为在胞质的瞬间表达，无基因病之虞，因此为一种高效、安全、靶向的导入系统。为探索GE7导入系统介导HSV-TK自杀基因治疗卵巢癌，本文进行了以下几部分研究： 1 GE7/Pcmv-tk及GE7/Pcmv-β gal系统的构建1）真核重组表达质粒Pcmv-tk pcmv-β gal的构建用EcoR I及XhoL I酶切逆转录病毒重组表达载体PLtkSN及空载体Pcmv-script，获得目的基因片段TK及载体片段，链接后转化，获得Pcmv-tk亚克隆质粒；为使报告基因在同等条件下反映GE7系统的转导效率，用上述同样方法构建pcmv-β gal质粒；2）GE7非病毒载体的构建3）GE7/DNA四元体复合体的构建 2 GE7导入系统介导报告基因β-半乳糖苷酶基因转导卵巢癌细胞 目的：用GE7导入系统介导，将E.coli β-半乳糖苷酶基因导入卵巢癌细胞SKOV3、CaOV3中，了解其转导效率，为进一步探讨该载体用于卵巢癌基因 治疗提供研究基础。方法：用兔疫组化染色测定SKOV3上a0V3卵巢癌细胞的EGFR， 用p－半乳糖昔酶组织化学染色估计基因导入率。结果：SKOV3、Ca0V3卵巢癌 细胞质、细胞膜上EGFR均丰富，分别为88％和91％。GE7导入系统对卵巢癌细 胞 SKOV3、Ca0V3的基因导入效率分别为 3％、75％。在 Ca0V3中主要导人细胞质 中。 3 GE7导入系统介导 HSV ITK基因转染卵巢癌细胞后基因表达的检测 应用 GE7导入系统介导 HSV k基因转导卵巢癌细胞 CaOV3 SKOV3细 胞，通过Northern blot了解HSVltk基因导入后是否出现相应的rnRNA，以此来 推测 HSV ltk的蛋白表达情况。结果：HSV ltk基因转导后，Ca0V3细胞 N。them hi。t出现了阳性条带，而 SKOV3细胞未发现。说明 HSV．tk基因通过 GE7导 入系统导入在部分卵巢癌细胞中可以表达。 4 HSV1K基因转导卵巢癌细胞后的生物学功能 目的：观察 GCV对转导 HSV ITK的 SKOV3、Ca0V3细胞的体外杀伤作用 及对细胞周期的影响，探索其作用机理，并为临床应用提供研究基础。方法： （1）用MTT法狈定不同浓度“V对导入HSVI－Tk基因的SKOV3、Ca0V3了巢癌 细胞在不同时间的生长抑制率；（2）应用流式细胞仪测定凋亡细胞比例及细胞 周期比例。结果：不同剂量的GCV对转导HSV1K的Ca0V3细胞产生不同的生 长抑制率，且存在着效应－剂量和时间－效应关系；生长抑制作用在细胞转导后 第三天最为明显，第 5天后开始下降，且与 GCV浓度成正比，当 GCV为 10Ug／ml 时，生长抑制率可达 95％；转导自杀基因的细胞经 GCV作用后，S期上升明 显，以S期和GI期为主；凋亡指数在GCV作用后明显上升，最高达30。