牙周病是指发生在牙周软硬组织上的慢性、非特异性、感染性疾病。根据程度不同，其临床表现及治疗方法各异。其主要表现为牙龈炎症、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收甚至牙齿松动脱落。对严重的牙周病，最后常需通过修复手段，如植骨术或引导组织再生术（Guided tissue regeneration,GTR）重建已丧失的牙周组织，形成新的牙周组织和新附着。目前利用在牙周缺损处局部移植骨髓干细胞、牙周韧带细胞、牙囊细胞等促进牙槽骨再生的牙周组织工程研究较多。牙囊细胞（dental follicle cells,DFCS）来源于牙囊，是一组具有多种生物学功能和分化潜能的多能干细胞，是牙周组织工程的种子细胞之一。可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞及未分化间充质细胞形成牙周组织，在牙周病治疗中起原始生成的作用。牙周病治疗最关键的是形成新的牙槽骨，通过DFCS在牙周缺损区的成骨分化作用，增加骨量形成牙周病的硬组织基础，在牙周修复中具有很大一部分的作用。牙囊细胞体外培养易丧失自我更新能力、发生老化，且纯化非常困难，难以实现大量扩增，制约了其在牙周组织工程中的研究应用。1989年Cloud等首次将体细胞永生化并保持了原细胞的特性且未产生癌变倾向。永生化指体外培养的细胞经过自发的或外界干扰而避免增殖衰老，具备无限增殖能力的过程。本实验研究大鼠牙囊细胞的永生化方法及其永生化后的成骨特性，为后期相关实验提供足够数量的牙囊细胞。目的：1．拟将外源性SV40T-Ag病毒转染至体外培养的大鼠牙囊细胞中，建立永生化的大鼠牙囊细胞系。2．观察永生化大鼠牙囊细胞的生物学特性及其成骨分化的潜能。3．为后续的牙周组织工程研究提供充足的大鼠牙囊细胞。方法：1．组织块法及酶消化法相结合培养原代大鼠牙囊细胞，通过差数贴壁法传代分离纯化大鼠牙囊细胞，进行形态学观察（光镜）、细胞组织学来源鉴定、绘制细胞生长曲线，为下一步永生化提供实验细胞。2．采用第3或4代大鼠牙囊细胞，利用293细胞包装病毒构建含SV40T-Ag的逆转录病毒载体，制备重组逆转录病毒并转染大鼠牙囊细胞，建立永生化的大鼠牙囊细胞系。3．Real-time PCR检测SV40T-Ag病毒在实验组大鼠牙囊细胞基因中的整合情况。4. Westen Blot分析实验组大鼠牙囊细胞端粒酶长度5．实验组大鼠牙囊细胞成骨特性分析(ALP、OC、BMP2、runx2)。6．实验组大鼠牙囊细胞生长曲线和增殖特征观察。7．实验组大鼠牙囊细胞克隆形成能力检测。结果：1．成功培养出大鼠牙囊细胞，其形态及生长均与文献报道相近，组织学鉴定细胞来源于外胚层。2.成功构建含SV40T-Ag的逆转录病毒载体大鼠牙囊细胞，且大鼠牙囊细胞端粒酶活性增强。3．永生化后大鼠牙囊细胞ALP、OC、BMP2、runx2成骨指标与对照组无统计学差异。结论：1．利用293细胞包装病毒，构建SV40T-Ag逆转录病毒载体对大鼠牙囊细胞的转染是成功的。2．永生化对大鼠牙囊细胞成骨分化基本无影响。