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阐明卵母细胞成熟的机制以及成熟障碍的影响因素,是医学界亟待解决的科学临床问题!其周围的颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）为卵母细胞的成熟提供了唯一的生存微环境,其功能直接决定卵母细胞的成熟状态。已有报道,氧化应激是引起颗粒细胞功能异常也是导致卵母细胞成熟障碍的重要原因。壳寡糖（Chitosan oligosacchrides,COS）是一种无毒副作用的天然碱性氨基寡糖,具有抗氧化应激、抗炎症等重要的作用。我们课题组前期发现,COS能明显增加不孕模型小鼠卵泡数量,并能延缓卵巢衰老。这是否与其抗氧化应激,从而改善颗粒细胞和卵母细胞的功能有关尚未阐明,具体调控的信号通路尚不清楚。故本研究以人卵巢颗粒细胞系（KGN细胞）、小鼠原代颗粒细胞、小鼠生发泡（Germinal vesicle,GV）期卵母细胞为研究对象,探讨COS在离体和在体内氧化应激状态下是否对卵巢颗粒细胞和卵母细胞具有保护作用,分析缺氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）和血管内皮生长因子A（Vascular endothelial-derived growth factor-A,VEGF-A）信号通路在介导这种作用中的意义。本研究首次在人体和动物中系统地观察了COS在H2O2和3-NPA两种氧化应激状态下对颗粒细胞氧化损伤的保护作用;证明COS能促进体外培养的卵母细胞成熟、提高卵母细胞质量;阐明COS可能通过HIF-1α-VEGF-A信号通路调控线粒体功能发挥其抗氧化应激损伤从而保护卵巢功能的作用。为寻找改善卵母细胞成熟障碍的方法提供科学依据和新的思路。第一部分壳寡糖通过降低氧化应激水平保护人颗粒细胞系（KGN细胞）为了研究COS保护人颗粒细胞系KGN细胞及H2O2引起KGN细胞氧化应激损伤的作用,本部分实验通过PCR、Western blot、β-半乳糖苷酶染色、流式细胞和免疫荧光等实验技术,发现:（1）COS降低KGN细胞氧化应激水平。100μg/ml浓度的COS作用KGN细胞24 h可以显著提高KGN细胞活力,增加雌二醇（Estradiol,E2）和孕酮（Progesterone,P4）的分泌以及细胞谷胱甘肽（Glutathione,GSH）含量,降低其氧化应激相关指标如8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OHd G）和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）的表达,并使促炎因子白介素-6（Interleukin-6,IL-6）显著降低,抗炎因子白介素-10（Interleukin-10,IL-10）、转化生长因子β1（Transforming growth factor beta-1,TGF-β1）显著升高,同时伴有HIF-1α和VEGF-A m RNA以及蛋白水平的降低。（2）COS保护H2O2致KGN细胞氧化应激损伤:（1）COS能逆转H2O2引起的KGN细胞活力下降、线粒体数量减少和功能缺陷、E2和P4的分泌下降以及细胞凋亡率升高,能逆转由H2O2引起的KGN细胞GSH含量下降、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量升高、8-OHd G、4-HNE、HIF-1α和VEGF-A水平升高,能逆转由H2O2引起的KGN细胞IL-6含量的升高、IL-10和TGF-β1水平的下降以及衰老相关的β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）蛋白表达的升高。（2）利用HIF-1α蛋白抑制剂KC7F2,能逆转由H2O2诱导引起的VEGF-A升高、IL-6升高、IL-10和TGF-β1蛋白质水平降低、E2和P4降低、SA-β-gal表达增多、Mito Tracker染色减少、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）降低、GSH含量下降、细胞活力下降。此外,KC7F2能逆转由H2O2引起的KGN细胞4-HNE和8-OHd G水平、ROS释放、细胞凋亡率的增高。（3）COS和KC7F2对以上结果均有协同作用。上述离体人颗粒细胞实验提示,COS能减轻正常KGN细胞的氧化应激水平,也能减轻H2O2诱导的KGN细胞氧化应激损伤,其机制可能为通过HIF-1α-VEGF-A通路从而稳定线粒体功能有关。第二部分壳寡糖在整体能保护小鼠颗粒细胞避免氧化应激损伤为了在整体研究COS对氧化应激损伤后卵巢颗粒细胞的保护作用并探讨其作用机制,本部分实验同样通过PCR、Western blot、β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光和ELISA等实验技术,发现:（1）COS能够逆转在体3-NPA应激后小鼠颗粒细胞的活力下降、线粒体数量减少和功能缺陷、E2和P4分泌下降,逆转在整体3-NPA应激后小鼠颗粒细胞的GSH含量下降、ROS含量升高、以及8-OHd G和4-HNE、HIF-1α和VEGF-A水平升高,逆转在体3-NPA应激后小鼠颗粒细胞的IL-6水平增高、IL-10和TGF-β1水平的下降、SA-β-gal蛋白表达的升高。（2）利用HIF-1α蛋白抑制剂KC7F2,由3-NPA诱导引起的VEGF-A和IL-6升高、IL-10和TGF-β1降低、E2和P4降低、SA-β-gal表达增多、Mito Tracker染色减少、MMP下降、GSH含量下降、细胞活力下降均被逆转。此外,KC7F2能够抑制3-NPA诱导引起的4-HNE和8-OHd G水平升高、ROS释放增多。（3）COS和KC7F2对以上结果均有协同作用。上述结果进一步提示,COS对在体3-NPA氧化应激引起的颗粒细胞功能损伤同样具有保护作用,其机制也可能是通过HIF-1α-VEGF-A通路从而稳定线粒体功能有关。第三部分壳寡糖在整体能保护小鼠卵母细胞避免氧化应激损伤为了研究COS对在整体卵母细胞氧化应激损伤后的保护作用并探讨其作用机制,本部分实验通过小鼠GV期卵母细胞的体外培养成熟、纺锤体的荧光染色、PCR、ROS染色、GSH含量检测、线粒体数量和MMPΔΨm检测等实验技术,发现:（1）COS能够显著逆转3-NPA应激后小鼠卵母细胞第一极体排出率、纺锤体形态的异常率的增高以及线粒体数量和MMP的下降,COS能显著缓解3-NPA应激后ROS水平增高、GSH含量降低。（2）加入HIF-1α抑制剂KC7F2时,显著逆转3-NPA应激引起的第一极体排出率下降、纺锤体形态异常率增高、Mito Tracker染色减少、MMP下降、ROS释放增加和GSH含量的下降。（3）COS和KC7F2对以上结果均有协同作用。上述结果提示,COS对3-NPA氧化应激引起的卵母细胞成熟障碍和质量下降具有保护作用,其机制可能也与通过HIF-1α-VEGF-A通路从而稳定线粒体功能有关。综上,COS对H2O2和3-NPA两种氧化应激状态下对颗粒细胞氧化损伤的保护作用;能直接促进体外培养的卵母细胞成熟、提高卵母细胞质量;是通过HIF-1α-VEGF-A信号通路调控线粒体功能发挥其抗氧化应激损伤从而保护卵巢功能。