【摘 要】
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脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种能够引起大规模人畜共患传染病和大量家畜死亡的病原体,被广泛用于研究抗病毒免疫、病毒性心肌炎和胰岛素依赖型糖尿病等的模型。已有研究发现RLR介导的IFN信号通路在EMCV感染过程中发挥重要作用,固有免疫通过激活干扰素和促炎细胞因子的产生对病毒感染作出反应,其中产生的TRIM家族蛋白,对多种病毒的感染具有调控作用。本研
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脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种能够引起大规模人畜共患传染病和大量家畜死亡的病原体,被广泛用于研究抗病毒免疫、病毒性心肌炎和胰岛素依赖型糖尿病等的模型。已有研究发现RLR介导的IFN信号通路在EMCV感染过程中发挥重要作用,固有免疫通过激活干扰素和促炎细胞因子的产生对病毒感染作出反应,其中产生的TRIM家族蛋白,对多种病毒的感染具有调控作用。本研究以具有自身多聚泛素化修饰的E3泛素连接酶作用的TRIM13作为研究对象,分别通过上调、下调蛋白表达水平,观察其对EMCV的作用,并对机制进行了初步探索,得到以下结果:1、EMCV感染HEK293细胞后,TRIM13的mRNA水平随病毒感染时间逐渐升高,TRIM13蛋白在病毒感染的36h和48h时与同期未接毒组相比显著上调,提示TRIM13与EMCV体外感染宿主细胞相关。2、通过构建TRIM13表达上调和下调的细胞并进行EMCV感染试验,结果证明,TRIM13表达增加可显著促进EMCV的增殖(P<0.05);利用靶向TRIM13的RNA干扰序列下调TRIM13后,显著抑制EMCV在细胞中的复制增殖(P<0.05)。3、EMCV吸附和侵入试验结果提示,TRIM13过表达显著促进EMCV的侵入(P<0.05),干扰后病毒侵入明显被抑制(P<0.05)。但无论TRIM13过表达还是干扰,病毒的吸附均无改变。4、EMCV感染TRIM13过表达的HEK293细胞,通过qRT-PCR和ELISA试验检测IFN信号通路分子和炎症因子的表达。结果提示TRIM13抑制由EMCV触发的IFN-β信号通路分子和细胞炎症因子IL-6、TNF-α的表达。5、不同浓度TRIM13真核表达质粒和干扰素通路关键适配器分子MDA5、MAVS和TBK1共转染HEK293细胞,qRT-PCR结果提示TRIM13抑制由适配器分子MDA5、MAVS和TBK1介导的IFN-β的表达,且呈浓度依赖性;WB结果显示TRIM13能直接抑制MAVS和TBK1的表达;当TRIM13被下调后,MAVS和TBK1的蛋白表达增加,进而促进IFN-β的mRNA和蛋白表达。通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验发现TRIM13与MAVS、TBK1相互作用,且共定位于胞质中。上述结果表明了TRIM13与EMCV在HEK293细胞中的复制增殖呈正相关,且参与病毒的侵入过程。不同浓度TRIM13真核表达质粒和干扰素通路关键适配器分子MDA5、MAVS和TBK1共转染HEK293细胞的结果提示TRIM13通过负调控IFN-I信号通路和炎症因子的表达抑制ISG的产生,进而促进了病毒感染宿主细胞的能力。
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