目的探讨清热化湿中药(清胰化积方,QYHJ)抗胰腺癌过程中肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的作用。方法第一部分1.建立胰腺癌皮下移植瘤模型,分成QYHJ组和生理盐水对照组,评价QYHJ对胰腺癌生长的影响。2.建立胰腺癌原位移植瘤模型,分成QYHJ组和生理盐水对照组,评价QYHJ对胰腺癌肝转移的影响。第二部分1.家兔胃饲QYHJ获取含中药血清,并取正常家兔血清为对照组。56℃水浴锅,30分钟,制备灭活的中药血清及正常血清。2.CCK-8法测定正常血清、正常灭活血清、中药血清、中药灭活血清对人胰腺癌细胞体外增殖的影响,并绘制细胞增殖曲线。3.体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测正常血清、正常灭活血清、中药血清、中药灭活血清对人胰腺癌细胞体外迁移及侵袭能力的影响。第三部分1.采用原代培养的方法建立两对人胰腺正常成纤维细胞(NFs)及对应的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)。2.采用免疫荧光(ICC)及Western-blot对原代培养成的成纤维细胞进行鉴定。3.采用RT-PCR、Western-blot技术检测NFs、CAFs及经含药血清处理的CAFs之间CXCL1、2、8表达的差异。4.CCK-8法测定含中药血清对CAFs体外增殖的影响。5.采用免疫组化技术评价QYHJ干预后CAFs在小鼠移植瘤中增殖能力的变化。6.采用免疫组化及Elisa技术评价CAFs表达、分泌CXCL1、2、8能力的改变。第四部分1.体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测CXCL1、2、8对人胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。2.体外成球实验检测CXCL8/CXCR1对人胰腺癌细胞干性的影响。3.流式细胞技术检测CXCL8/CXCR1对人胰腺癌干细胞比例的影响。4.免疫组化法检测人体组织中CXCR1与干细胞标记物CD24/44/133的表达水平。5.统计分析CXCR1及CD24/44/133之间表达水平的相关性。6.统计临床资料分析CXCR1表达水平与胰腺癌患者临床特征之间的相关性。7.单因素及多因素分析CXCR1表达水平与胰腺癌患者预后的关系。第五部分体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测NFs、CAFs及经含中药血清处理的CAFs上清对人胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。结果第一部分在皮下移植瘤实验中,QYHJ组和Control组的成瘤率均达到100%。但Control组与QYHJ组之间肿瘤生长速度存在差异,中药组经过QYHJ干预后肿瘤的生长速度低于Control组,从QYHJ干预第15天开始两组之间肿瘤的生长速度就出现了明显差异(P<0.05)。第21天处死裸鼠,发现QYHJ组平均瘤重小于Control组,Control组和QYHJ组的瘤重分别为0.705±0.198809g、0.435429±0.151751g,抑瘤率为38.24%(P<0.05)。在原位移植瘤实验中,QYHJ组原位移植瘤的体积明显小于对照组,并且QYHJ组小鼠肝脏转移灶的数目(P=0.042)及转移率(P=0.002)也明显少于对照组。提示QYHJ可以有效地抑制胰腺癌的增殖及转移。第二部分四组血清对人胰腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭的抑制能力有显著差异,从高到低分别为中药组、正常、中药灭活组、正常灭活组。正常组高于正常灭活组,这可能和机体在正常情况下的免疫反应有关。中药灭活组高于正常灭活组,这可能和中药有效成分本身对于胰腺癌细胞的直接作用有关。中药组高于中药灭活组,提示中药抗胰腺癌存在间接作用,且这部分间接作用能够有效地抑制胰腺癌的恶性潜能。第三部分经过原代培养建立起两对(#1,#2)相应的NFs和CAFs细胞,并选取上皮细胞标记物人广谱细胞角蛋白(Pan Cytokeration[AE1/AE3], CK)、E-cadherin,间质标记物Vimentin及CAFs特异性标记物α-SMA,通过免疫荧光(ICC)和Western-blot的方法对其进行鉴定。结果显示NFs和CAFs都不表达上皮细胞标记物CK及E-cadherin,但都表达间质标记物Vimentin, CAFs还高表达其特异指标α-SMA。提示我们成功建立起人胰腺NFs及胰腺癌CAFs。我们进一步检测了成纤维细胞分泌的CXCL家族的几个因子的表达。结果显示CXCL1、2、8在CAFs中的表达明显高于NFs,且在用QYHJ干预后CAFs中的CXCL1、2、8表达明显下调。体内免疫组化的结果也提示QYHJ组中CXCL1、2、8的阳性率明显降低,进一步检测小鼠血清中CXCLs的含量,发现它们在Control和QYHJ组中含量分别为57.49±5.07pg/LVS43.27±7.01pg/L(P<0.05);42.88±4.00pg/L VS33.92±1.42pg/L(P<0.05);343.03±50.68pg/L VS190.52±39.36pg/L(P<0.05)。同时我们也观察了QYHJ对CAFs增殖的影响,体外增殖实验中QYHJ组OD值明显低于Control组,体内的免疫组化结果提示QYHJ干预后Vimentin和a-SMA表达明显下降,提示QYHJ能抑制CAFs的增殖。第四部分在迁移和侵袭实验当中CXCL1、2、8干预组中Capanl细胞的穿过数量都高于对照组和抑制剂组(P<0.05)。成球实验中CXCL8组中干细胞球的数量明显多于对照组(P=0.000),在加入抑制剂后CXCL8诱导的干细胞成球能力受到抑制(P=0.002)。在CXCL8诱导后Capanl干细胞比例明显高于对照组(P=0.002)和抑制剂组(P=0.03)。临床资料的分析结果显示CXCR1和胰腺癌干细胞标记物CD44/133表达呈正相关,并且和胰腺癌淋巴结转移关系密切。同时CXCR1、CD44/133也和胰腺癌患者的预后相关,CXCR1是胰腺癌患者预后的一个独立相关因素。第五部分NFs组及QYHJ干预后的CAFs条件培养基组比CAFs条件培养基组Capanl细胞穿透数量更少(P<0.05)。结论QYHJ可以有效地抑制胰腺癌细胞的增殖及远处转移,它的这种作用除了本身有效成分之外,还存在间接作用,其中的一个间接靶点在于CAFs。QYHJ可以通过抑制CAFs的增殖以及抑制CAFs分泌CXCL1、2、8间接地达到抗胰腺癌的作用。这种作用主要包括两个方面,胰腺癌细胞的迁移、侵袭以及胰腺癌细胞的干性。