【研究背景及目的】鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤之一,以南方地区尤为高发,放疗被认为是首选的治疗手段。然而,临床上部分病人放疗后出现局部残留与局部复发,肿瘤细胞的放射抗拒性是重要原因之一。目前国内外在基因水平上对肿瘤放射抗拒机制进行了大量的研究,发现与细胞周期调控、细胞凋亡及DNA损伤修复等相关基因及蛋白有关,但尚未发现在鼻咽癌表达中能良好预测肿瘤放射抗拒性和预后的基因或蛋白,据推测主要原因可能为mRNA的表达丰度与其相应的蛋白质表达水平的不一致性造成的。由此得知,鼻咽癌放射抗拒机制的发生并非由单一基因或蛋白改变引起,而是多基因或蛋白构成的分子网络相互作用的结果。因此,应用蛋白质组学技术为从蛋白质表达水平进一步探讨鼻咽癌放射抗拒机制提供可能性。目前,鼻咽癌的蛋白质组学研究主要集中于鼻咽癌的早期诊断和筛选肿瘤标志物等方面。以体外培养的肿瘤细胞为研究对象,可以避免临床组织样本引起的组织异质性、影响因素复杂、阳性结果易丢失等诸多缺点。因此,从体外培养的肿瘤细胞系开始逐步过渡到临床成为当今研究放射抗拒机制的主要方法之一。本研究旨在应用蛋白质组学技术寻找与鼻咽癌放射抗拒发生相关的候选蛋白,通过建立和优化细胞蛋白质样品的制备方法,再对具有稳定放射抗拒性的鼻咽癌细胞系及其亲本细胞系进行比较蛋白质组学分析,从而找到与放射抗拒相关的差异表达蛋白。拟在蛋白质表达水平初步阐明鼻咽癌放射抗拒的分子机制,为后续候选蛋白的生物学、功能验证及动物实验奠定基础,为今后临床预测鼻咽癌病人个体放射敏感性并实施个体化放疗提供新的思路。【研究方法】1、分别采用三种方法对人鼻咽癌细胞CNE-2进行总蛋白质的提取和双向电泳分析,建立稳定性与重复性俱佳的细胞蛋白质样品制备方法。2、体外培养具有稳定放射抗拒性细胞株CNE-2R及其亲本细胞株CNE2,分别提取处于对数生长期的CNE-2R、CNE2细胞总蛋白。采用双向凝胶电泳(2-DE)即第一向固相pH梯度电泳、第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离细胞CNE-2R、CNE-2的总蛋白。3、电泳后经硝酸银染色,应用ImageMaster 2-DE Platinum 5.0软件对凝胶进行分析,表达水平相差2倍以上的蛋白质点为差异蛋白点,切取胶上的差异蛋白质点,并行脱色、酶解、萃取,为后续质谱分析奠定基础。4、应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS)技术对选取的差异蛋白斑点,进行蛋白质鉴定分析。在Mascot蛋白数据库中检索,进行蛋白的鉴定,通过人工检索文献数据库,深入分析蛋白质的功能。【研究结果】1、采用通用裂解液裂解细胞,等电聚焦前在样品中加入Destreak试剂,可以获得稳定性好、图像清晰、分辨率高的双向电泳图谱。2、通过双向凝胶电泳技术,使具有稳定放射抗拒性细胞株CNE-2R及其亲本细胞株CNE-2的总蛋白得到较好的分离。运用ImageMaster 2-DE Platinum 5.0软件筛选出放射抗拒细胞系CNE-2R和亲本细胞系CNE-2之间差异在2倍以上的差异蛋白质点32个。3、对筛选出的32个表达差异的蛋白质点进一步行质谱鉴定,其中11个蛋白质点被成功鉴定,并进一步行生物信息学分析,发现大多数的蛋白为信号转导相关蛋白、分子伴侣、细胞骨架成分,在生物学功能方面主要与凋亡调节、细胞周期调控、RNA转录、信号转导、细胞骨架组成和辐射应激反应等有关。这些蛋白可作为放射治疗的潜在靶点,成为提高肿瘤放射敏感性的有效途径,具有深入研究的价值,为鼻咽癌的放射治疗研究提供新的研究思路和方法。【研究结论】2-DE结合MALDI-TOF-MS技术能够有效地识别和鉴定鼻咽癌放疗抗拒细胞与其亲本细胞系之间差异表达的蛋白质。本研究发现11个差异表达蛋白质,其功能涉及多种生理代谢和调节过程,提示鼻咽癌的放射抗拒性可能是多种蛋白质共同作用的结果,其中可能参与鼻咽癌放射抗拒性的发生。