精卵结合是成功受精的关键环节之一,近年来研究发现,在女性生殖道内,存在一系列引导精子向卵细胞运行的机制以保证受精能顺利进行,精子的趋化性是众多机制之一。目前用于精子趋化行为的工具都存在一定的缺陷,且只能做到对精子进行实时分析,无法对精子进行回收用于后续研究,在一定程度上阻碍了对精子趋化行为机制及生物学意义的探索。微流控芯片是近20年兴起的一种基于分析化学的研究平台,通过使用微加工技术制造出尺寸为纳米一微米级的沟道系统,向其中注入微量液体进行实验研究。使用微流控芯片可构建稳定可控的浓度梯度,在进行精子趋化行为研究方面具有诸多优势,然而太过复杂的结构不便于研究者对芯片操作的掌握和普及。本研究旨在利用微流控技术构建一种能够产生稳定浓度梯度且易于操作的微流控芯片,以用于研究使精子的趋化行为,以此为平台探索孕激素对人类精子趋化行为的影响,为微流控在精子研究领域的应用提出新的思路。结果证实,所设计的芯片中能够产生稳定的浓度梯度,且可同时进行三组平行实验,操作简单。在这种结构的芯片中,除浓度梯度外,不会引入其他变量的干扰。使用这一装置,我们成功地观察到暴露于孕激素浓度梯度中的精子表现出趋化特性,且较高浓度的孕激素还可引起精子活力的增强。在将来的工作中,我们将进一步开发此芯片的实用价值,使其能够服务于临床。第一部分构建一种能够产生稳定浓度梯度的微流控芯片目的构建一种易于掌握、浓度梯度相对稳定的微流控芯片,使其在尺寸上接近生殖道内精子所处的输卵管微环境,在梯度形成上近似在体卵丘复合物周围的化学物质浓度梯度分布,并对芯片中的浓度梯度分布情况进行理论模拟和荧光表征验证。方法在AutoCAD软件中设计芯片结构为一个六边形的中央池和周围六条U形通道围绕而成,每条U形通道通过15条细小的连接通道与六边形的每一条边相连。使用双层光刻法制作模板,模塑法制作聚二甲基硅氧烷芯片。在Comsol Multiphysic s软件中对芯片中所形成的浓度梯度进行理论模拟。再使用荧光素溶液对芯片中实际所形成的浓度梯度进行表征。结果经Comsol Multiphysics模拟显示,六边形池中的浓度梯度分布表现为自边缘向池中心逐渐递减。荧光表征结果显示,在每种静水压差下,均可观察到中央池中自六边形边向中心大致递减的荧光分布,随时间的增加,中央池中整体荧光强度逐渐增强；半定量分析显示静水压差最小组梯度形成欠规律,当静水压差增加时,可形成较为规律的线性梯度。结论本研究所设计的芯片可形成稳定的浓度梯度,梯度维持时间合适,其分辨率为微米尺度范围,接近生理性梯度分布,可用于精子趋化行为的研究。第二部分芯片中的液体流动对精子运动的影响目的探究所设计芯片中的液流分布情况,以及液体流动可能对精子造成的影响。方法使用Comsol Multiphysics模拟芯片中压强和流速分布情况。向其中一条外周通道中加入荧光微球溶液,其他通道及中央池加入超纯水,以观察液体流动,用Image J软件描记微球运动轨迹,计算单位时间内平均位移值以获得流速信息。再向六边形中央池中加入荧光微球溶液,其余通道加入超纯水,观察中央池中的液体流动。结果理论模拟结果显示,在三种不同的静水压差下,通道中的整体流速随出入口间静水压差的增加而加快,其中外周通道流速最大,当流经细连接通道时,流速大幅降低,到达中央池时流速不足1μm/s。使用荧光微球对流速进行表征的结果与理论模拟结果相似。当仅在中央池中加入荧光微球而其他通道中加入超纯水时,可观察到中央池中的荧光微球并无明显位移,液体流速接近于0。结论在所设计的微流控芯片中,中央池里浓度梯度形成的区域几乎不存在液体流动,浓度梯度的形成主要以扩散为主,也不会存在液体流动对精子的干扰。第三部分孕激素浓度梯度对精子趋化行为的影响目的使用微流控芯片观察孕激素浓度梯度对精子运动行为的影响,验证所设计芯片用于精子趋化行为研究的可行性。方法在芯片的外周通道中加入浓度为100 pmol/L和1 mmol/L的孕酮溶液,通过扩散作用在中央池中形成浓度梯度,对照组加入不含孕酮的溶液。精子经梯度离心处理后获能4小时,然后加入中央池中。加样后15 min记录精子的运动行为,使用Image J分析精子的运动轨迹,比较各组间精子各项运动参数的差异。结果经梯度离心处理后精子活力明显增加（p<0.05）。在浓度为100 pmol/L和1mmol/L的孕酮溶液所形成的浓度梯度中,均可观察到精子的趋化现象（p<0.05）。在1mmol/L孕酮溶液所形成的浓度梯度中,可观察到精子运动能力增强,线性运动程度减弱,100 pmol/L组则无此现象。结论所设计的芯片可用于精子趋化行为的研究；孕激素可引起精子的趋化行为,当其浓度较高时可引起精子运动能力的增强。