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PBLD(Phenazine Biosynthesis Like Protein Domain Containing,吩嗪生物合成类蛋白质结构域)是在2001年由Iriyama等利用酵母双杂交技术,以STRAP(丝氨酸/苏氨酸受体激酶相关蛋白)为诱饵,从人的肝脏cDNA库中经过筛选、分离得到全长的目标克隆。PBLD作为吩嗪生物合成蛋白(phenazine biosynthesis-like protein)家族的唯一成员,近年来相继有诸多文献报道其广泛分布在人体的大脑、心脏、肺、肝脏、胰腺以及肾脏等多种组织中;同时,有越来越多报道PBLD在不同的肿瘤组织中表达水平也不尽相同,并且其表达水平往往与多种肿瘤的发生发展具有一定的相关性。然而,在肾透明细胞癌中与PBLD相关的研究在还尚未见报道。目的:研究PBLD基因在肾透明细胞癌中的表达情况以及其对肾透明细胞癌细胞多种细胞系生长、迁移等生物学功能的影响,初步探讨PBLD在肾透明细胞癌中潜在的作用机制,为肾透明细胞癌诊断和治疗提供可能的理论依据以及实验基础。方法:1.运用TCGA公共数据库挖掘并分析肾透明细胞癌及其癌旁正常肾组织中PBLD的表达情况,分析PBLD的表达水平与肾透明细胞癌患者生存期之间的关系,并对该基因的生物学功能做初步预测。2.利用免疫组织化学染色的方法检测25对肾透明细胞癌组织标本及其癌旁正常肾组织中PBLD的表达情况。3.使用RT-PCR技术分析50对肾透明细胞癌组织及其癌旁正常肾组织中PBLD mRNA的表达情况,同时使用x2检验对PBLD mRNA的表达与肾透明细胞癌患者的临床病理学特点之间的关系进行进一步分析。4.使用Western Blot技术检测人正常肾细胞293T、HKC和人肾透明细胞癌细胞ACHN、A498、Caki-1、786-0各细胞系中PBLD的表达情况。通过慢病毒感染的方法将PBLD过表达载体以及空载体导入人肾透明细胞癌786-0和ACHN这两种细胞株中,构建出PBLD过表达和空载的对照稳转细胞株,同时结合RT-PCR、Western Blot等实验技术手段对PBLD的表达进行验证。5.通过WST-1法增殖实验和平板克隆形成实验来检测过表达的PBLD对786-O和ACHN这两种细胞增殖能力的影响;通过Transwell小室体外迁移模型和细胞划痕实验检测过表达的PBLD对786-0和ACHN这两种细胞迁移能力的影响。6.分别在裸鼠皮下接种已构建成功的稳转PBLD过表达载体以及空载对照的细胞株ACHN-PBLD和ACHN-NC,通过裸鼠成瘤实验在体观察过表达的PBLD对人肾透明细胞癌细胞移植瘤生长的影响。结果:1.TCGA数据分析表明PBLD在肾透明细胞癌组织中较癌旁的正常肾组织明显呈低表达,且低表达PBLD的患者总体生存率交高表达的患者更低;生物学预测显示PBLD可能与细胞的增殖、迁移等功能相关。2.免疫组织化学染色结果表明:在25对肾透明细胞癌组织及其癌旁正常肾组织中,在肾透明细胞癌组织中PBLD的表达明显低于其癌旁正常肾组织(P<0.001)。3.RT-PCR结果显示:在50对肾透明细胞癌组织及其癌旁正常肾组织中,在肾透明细胞癌组织中PBLD mRNA的表达水平较癌旁正常肾组织明显呈低表达(P<0.001),并且PBLD mRNA的表达水平越低,对应的肾透明细胞癌的临床病理组织学级别越高(P<0.05)。4.Western Blot检测结果显示:在人肾透明细胞癌细胞株ACHN、A498、Caki-1、786-0这四种细胞中PBLD较人正常肾细胞293T呈低表达,而正常肾细胞HKC中PBLD表达水平与293T细胞相比较低。使用PBLD过表达载体和空载慢病毒感染ACHN和786-0细胞株,并利用嘌呤霉素进行筛选从而构建出稳定PBLD过表达载体以及空载对照细胞:786-O-PBLD、786-O-NC;ACHN-PBLD、ACHN-NC。通过RT-PCR进行鉴定可见:786-O-PBLD中PBLD mRNA的表达水平显著高于786-O-NC(P<0.001);ACHN-PBLD中PBLD mRNA的表达水平显著高于ACHN-NC(P<0.001)。Western Blot鉴定显示:786-O-PBLD中PBLD的表达水平显著高于786-O-NC;ACHN-PBLD中PBLD蛋白的表达水平显著高于ACHN-NC。5.体外实验观察肾透明细胞癌稳转细胞株的生长和迁移能力。WST-1法增殖实验结果表明:在37℃细胞培养箱培养48h后,786-O-NC组细胞的增殖速率明显大于786-O-PBLD组(P<0.001);同样地,ACHN-NC组细胞的增殖速率明显大于ACHN-PBLD组(P<0.001),提示PBLD的过表达能明显抑制786-0细胞及ACHN细胞的增殖能力。平板克隆实验结果进一步表明:786-O-NC组细胞克隆数明显多于786-O-PBLD组(P<0.001);ACHN-NC组细胞的克隆数明显多于ACHN-PBLD组(P<0.001),提示PBLD的过表达能显著抑制786-0细胞和ACHN细胞的克隆形成能力。Transwell小室迁移实验表明:在细胞加入Transwell小室24h后,786-O-NC组细胞迁移个数明显多于786-O-PBLD组(P<0.001);同样地,ACHN-NC组细胞迁移个数明显多于ACHN-PBLD组(P<0.001)。细胞划痕实验结果表明,786-0细胞系的两组细胞在无差别划痕24h后,786-O-PBLD组细胞迁移距离明显短于786-O-NC组(P<0.001)。ACHN细胞系的两组细胞则在无差别划痕24 h后,ACHN-PBLD组迁移距离明显短于ACHN-NC组(P<0.001)。Transwell迁移实验和细胞划痕实验结果同时表明肾透明细胞癌细胞中PBLD的过表达对细胞的迁移能力具有明显的抑制作用。6.接种ACHN-NC细胞的裸鼠约在第10天时可于皮下部位可以触及实性包块,而接种ACHN-PBLD细胞的裸鼠则在12天时方可在其皮下部位触及实性包块。处死并解剖裸鼠后,将切下的肿瘤组织进行测量,ACHN-NC组肿瘤体积明显大于ACHN-PBLD组(P<0.05)。裸鼠成瘤实验研究表明PBLD的过表达可以降低ACHN细胞在裸鼠皮下的成瘤能力,同时抑制肿瘤在体内的生长。结论:1.PBLD和mRNA在肾透明细胞癌中呈低表达,且PBLD mRNA低表达与肾透明细胞癌病理组织分级相关。2.PBLD低表达与肾透明细胞癌患者总体生存率下降显著相关。3.PBLD能够抑制肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移,并且能够抑制肾透明细胞癌细胞在裸鼠体内成瘤能力及移植瘤的生长。