论文部分内容阅读
中国卤虫(Artemia sinica)在胚胎发育过程中,外界环境的改变能导致卤虫胚胎产生滞育现象。这一过程中,胚胎需要抑制细胞凋亡和调节细胞周期活动。小泛素相关修饰物(The small ubiquitin-related modifier-1,SUMO)是一种类泛素样的蛋白质翻译后修饰蛋白,在胚胎发育过程中发挥着重要作用。SUMO化修饰调节核转运、转录、染色体分离、基因表达、基因组稳定性等细胞活动。目前,卤虫的滞育机制和As-sumo-1在卤虫滞育和早期胚胎中的作用一直没有研究,因此,本研究对进一步分析卤虫胚胎滞育和滞育解除过程中As-sumo-1对细胞周期、细胞凋亡的作用及由类泛素化引起的一系列滞育相关的分子机制具有较为重要的理论意义。本文首次克隆了中国卤虫As-sumo-1, As-sumo ligase, As-caspase-1, As-cyclin B基因全长,采用实时定量PCR作为检测As-sumo-1, As-sumo ligase, As-caspase-1, As-cyclin B基因在中国卤虫胚胎发育各时期及盐度胁迫状态下mRNA的表达水平及表达模式的手段,利用免疫印迹技术检测As-SUMO-1, p53, Mdm2, Caspase-1, Cyclin B和Cyclin E各蛋白在卤虫胚胎发育过程中蛋白表达水平及表达模式,利用小RNA干扰(smallinterfering RNA, siRNA)技术确定As-sumo-1在卤虫早期胚胎发育过程中的作用。结果显示,As-sumo-1基因全长467bp,编码92个氨基酸;As-caspase-1基因全长966bp,编码245个氨基酸;As-sumo ligase基因全长1556bp,编码343个氨基酸;As-cyclin B基因全长739bp,编码133个氨基酸。在基因水平上,As-sumo-1, As-caspase-1和As-cyclin B基因在中国卤虫胚胎发育10h表达量最高,而As-sumo ligase在0h表达量最高。在蛋白水平上,As-SUMO-1的免疫组化结果显示,无器官和组织的特异性;As-SUMO-1, p53,Mdm2, Caspase-1, Cyclin B和Cyclin E均在中国卤虫胚胎发育10h表达量最高。RNAi实验表明,As-sumo-1基因的敲低导致畸形率的升高。通过实验得到以下结论: sumo-1,sumo ligase,caspase-1,cyclin B这类细胞周期调控和细胞凋亡相关基因,在卤虫胚胎发育10h前上调,因为胚胎启动后进行的细胞增殖和细胞分裂需进行大量的物质储备,10h后表达量下调,相关活动减少,细胞开始分化,相关基因下调,最终维持在基础水平。实时荧光定量结果和Western blot结果都证实了这一推断。As-sumo-1功能多样,该基因敲低后,会出现发育迟缓的现象,出现畸形胚胎的可能性增大。As-sumo-1基因在卤虫滞育和早期胚胎发育过程中发挥重要的作用,尤其是在调控细胞周期和抑制细胞凋亡方面。