肺癌已成为全球范围内对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。在肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占80％-85％，其死亡率高达80％-90％，许多肺癌患者死亡的主要原因是发生了远端转移。随着分子生物学研究的不断进展，新的肿瘤标记物和治疗靶点为肺癌的诊断和治疗提供了全新的方向。MicroRNA(miRNA)的出现不但带动了肿瘤的研究，也大大改变了以往人们对非编码RNA的认知。miRNA是长约20到25个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，在转录后水平调控基因的表达和翻译，约30％的编码蛋白基因受其调控。miRNA参与生命过程中一系列重要的活动包括发育、器官形成、细胞增殖、凋亡等等，其与疾病的关系日益引起人们关注，近年来的研究表明miRNA与肿瘤的发生和发展密切相关。　　 研究表明miRNA在不同组织中表达具有特异性,在转录后水平对靶基因进行负向调控，由于单个miRNA可以作用于多个靶基因，而多个miRNA可以作用于同一靶基因，由此形成了miRNA复杂的调控网络。那些在肿瘤中高表达的miRNA通过抑制抑癌基因或控制细胞分化和凋亡的基因来促进肿瘤的发展被认为是癌基因如miR-372对抑癌基因LATS2的抑制作用;相反的在肿瘤中低表达的miRNA通过抑制癌基因或控制细胞分化和凋亡的基因来阻止肿瘤发展的被认为是抑癌基因，如let-7对原癌基因RAS的负调控。　　 hsa-miR-449a(miR-449a)在一些肿瘤中低表达，但其功能和作用机制尚不完全清楚。本研究拟定通过两部分探讨miR-449a在肺癌中的表达及临床意义，分析miR-449a对肺癌细胞迁移侵袭的影响。我们使用实时定量PCR检测了miR-449a在84例非小细胞肺癌组织与配对癌旁组织中的表达情况，并探讨了miR-449a表达水平与临床病理因素的关系。我们又检测了miR-449a在70例有随访资料的石蜡包埋组织(FFPETs)中的表达情况，探讨了miR-449a表达水平与预后的关系。在细胞中我们检测了miR-449a对细胞迁移和侵袭能力的影响，使用生物信息学软件对miR-449a的靶基因进行预测，并挑选可能的靶基因进行验证　　 材料与方法：　　 一、组织样品　　 84例非小细胞肺癌(NSCLCs)和癌旁肺组织(NATs，距离癌组织5cm以上)来自于中国医科大学附属第一医院及辽宁省肿瘤医院，70例石蜡包埋非小细胞肺癌组织来自于辽宁省肿瘤医院。本研究所有患者术前均未接受任何放化疗治疗。患者临床病理资料包括性别，年龄，发病部位，组织学类型，组织学分级，淋巴结转移和病理分期均摘自患者病历资料。根据WHO标准由两位病理诊断医师确定病理诊断、组织学分级、临床病理分期、淋巴结转移。84例非小细胞肺癌包括:男性59例，女性25例;年龄36～77岁（中位年龄60岁）;发病部位:右肺43例，左肺41例;鳞癌(SCC)41例，腺癌(AC)43例;组织学分级:高分化30例，中分化26例，低分化28例;病理分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为35例、32例和17例;淋巴结转移40例，无淋巴结转移44例。70例回顾性非小细胞肺癌病人随访截止时间2010年12月31日，中位随访时间36个月，截尾9例。　　 二、实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)　　 根据操作说明使用Trizol(Invitrogen，NY, USA)提取新鲜组织和细胞中的总RNA，使用miRNA Isolation Kit Am1975 RecoverAllTM(Ambion，Austin，USA)提取回顾性石蜡样本中的RNA。按操作说明使用RT引物和TaqMan探针在ABI7900HT(Applied Biosystems，Foster City, USA)中运行检测miR-449a(Applied Biosystems，Foster City, USA)的表达，RNU6B作为内参对照。经3次独立实验得到的数据使用公式RQ=2-△△Ct的方法进行分析。使用PrimerScript RT reagent kit(Takara，Dalian，China)合成cDNA，按操作说明用染料法在ABI7900HT(Applied Biosystems，FosterCity, USA)中运行检测样品中c-Met的表达，β-actin作为内参对照。c-Met的引物为F:5-GGCTGGTGGCACTTTACTTA-3,R:5-CTTGTCTCTCGGTTGGCTA-3,而β-actin引物为F:5-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3， R:5-ACATGCCGGAGCCGTTGT-3，循环结束后作出溶解曲线保证产物的特异性。经3次独立实验得到的数据使用公式RQ=2-△△Ct[37，38]的方法进行分析。　　 三、细胞培养和转染　　 LK2、A549用DMEM培养液（含有10％新生牛血清），SPC、LTE、H460、LH7、BE1、H1299、H157用RPMI1640培养液（含有10％新生牛血清，100u/ml的青霉素和l00μg/ml的链霉素）在37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，经3次传代稳定后，进行转染。使用HiPerFect Transfection Reagent(Qiagen，Hilden，German)作为转染试剂按操作说明向细胞转染miR-449a mimic，mimic control，miR-449a inhibitor,inhibitor control(RiboBio,Guangzhou,China)。c-Met siRNA(GenePharma,Shanghai,China)用于干扰c-Met的表达，序列为5-GUC AUA GGA AGA GGG CAU UTT-3（正义），and5-AAU GCC CUC UUC CUA UGA CTT-3（反义）。　　 四、Transwell迁移侵袭实验　　 迁移实验中细胞转染24h后，以0.25％胰蛋白酶消化收集。上室加入200ul用无血清培养基制成5×104个的单细胞悬液，下室加入500ul含10％FBS的培养基，37℃、5％ CO2孵箱培养;不同细胞系按不同时间终止培养后，PBS洗涤2次，以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，下室面的细胞用甲醇固定，HE染色，×200光镜下随机取5个视野计数细胞数，以其均值表示侵袭细胞数。每种细胞进行三次平行实验，计数均值，t检验分析各组之间差异。侵袭实验中膜的上室面铺50ul基质胶(Matrigel)，37℃保温2-4小时，上室加入200ul用无血清培养基制成的5×104个的单细胞悬液，下室加入500ul含10％FBS的培养基，37℃、5％C02孵箱培养;不同细胞系按不同时间终止培养后，PBS洗涤2次，以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，下室面的细胞用甲醇固定，HE染色，×200光镜下随机取5个视野计数细胞数，以其均值表示侵袭细胞数。每种细胞进行三次平行实验，计数均值，t检验分析各组之间差异。　　 五、Western blot检测　　 转染后48h提取各组织蛋白，根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS—聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量60μg，常规电泳、转膜、封闭，一抗4℃过夜孵育，二抗室温孵育2h，β-actin作为内对照。Western Lightning(R)-ECL，EnhancedChemiluminescence Substrate(Perkin Elmer，NEL100001EA)检测，显影。UVP图像处理系统采集图像，ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度。分别计算不同指标和β-actin的INT×S，用二者的比值显示不同指标的表达水平。　　 六、报告基因构建及检测　　 以A549细胞的eDNA文库为模板，扩增得到含有miR-449a预测靶位点的c-Met-3UTR序列。c-Met上、下游引物:5-GATCCTGCTAGTACTATGTCAAAGCAACAGTCCACACTTTGTCCAATGGTTTTTTCACTGCCTGAG-3和5-AATTCTCAGGCAGTGAAAAAACCATTGGACAAAGTGTGGACTGTTGCTTTGACATAGTACTAGCAG-3。利用BamHI及EcoRI酶切后连接到pcDNA3-EGFP荧光报告载体中(pcDNA3-EGFP-c-Met)。利用基因定点突变试剂盒构建含有突变靶位点的荧光报告质粒(pcDNA3-EGFP-c-Met-mut)。接种A549细胞于48孔板中，接终浓度为3×105/孔;接种后24小时，细胞达对数生长期，向细胞中共转染实验组质粒或对照组质粒;裂解细胞，提取蛋白;转染后48小时，向每孔中加入300ulRIPA裂解液;将48孔板放于4℃，摇床震荡30分钟，之后用移液器吹匀，并移入新EP管中;4℃，12000RPM离心10min，吸取上清，转移至新的EP管中，转染48小时后，于荧光Fluorescence spectrophotometer F4500(Hitachi，Tokyo，Japan)观测绿色荧光信号变化。　　 七、统计学分析　　 SPSS16.0用于所有的统计学分析。RT-qPCR结果数据经过log2转换,,结果用平均值和标准差进行描述。配对T检验用于分析miR-449a在非小细胞肺癌和癌旁肺组织中的差异。Chi-square检验(Chi-square test)用于分析miR-449a的表达水平与临床病理因素的关系。Mann-whitney检验(Mann-whitney test)用于病理分级，病理分期等级资料的分析。Spearman相关分析(Spearman correlation analysis)用于分析miR-449a与病理分期和淋巴结转移的相关性。细胞学实验采用独立t检验(independent samples T-test)及单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析。miR-449a的预后统计分析，Kaplan-Meier(log-rank test)单因素分析非小细胞肺癌中性别，年龄，肿物部位，肿物体积，病理分型，组织学分化，淋巴结状况，临床病理分期以及miR-449a表达水平对总生存率的影响，多因素COX模型分析非小细胞肺癌的独立性影响因素。p＜0.05为有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、miR-449a在非小细胞肺癌组织中的表达　　 使用miRCURYTM LNA Array(v.11.0)检测6例NSCLCs(3例鳞癌，3例腺癌)组织与NATs中miRNAs的表达差异，miR-449a在腺癌和鳞癌组织中的表达显著低于癌旁(by factors of0.0046 in AC and0.3322 in SCC)。　　 我们采用RT-qPCR相对定量方法检测miR-449a在84例NSCLCs及配对NATs中的表达情况，RNU6B作为内参对照，与NATs相比，84例NSCLCs中miR-449a表达低于NATs组织者有77例，Paired T-test检验结果显示NSCLCs中miR-449a表达明显低于NATs(p=0.004，t=-2.997)。　　 二、miR-449a与临床病理因素的关系　　 为了明确miR-449a在肿瘤发生发展中所起的作用，根据miR-449a在84例NSCLCs中的中位表达水平分为高、低表达两组，采用Chi-square Test，Mann-whitney Test分析了miR-449a表达水平与84例NSCLCs临床病理因素的关系。结果显示，miR-449a的表达水平与病理分期(p=0.012，Mann-Whitney U test)和淋巴结转移相关(p=0.029，chi-square test)，而miR-449a的表达与NSCLC患者性别、年龄、发病部位、肿瘤体积、病理分型、分化等均无相关性。为进一步明确miR-449a的表达水平与病理分期，淋巴结转移的关系，我们采用Spearman相关检验进行分析，结果显示miR-449a表达与病理分期(r=-0.276，p=0.011)和淋巴结转移(r=-0.238，p=0.029)呈负相关。　　 三、miR-449a表达与NSCLC患者预后关系　　 为研究miR-449a与NSCLC患者预后的关系，我们检测了有随访结果的70例石蜡包埋NSCLCs组织中miR-449a的表达水平。Kaplan-Meier生存分析显示，miR-449a低表达的患者预后比miR-449a高表达的患者差(log-rank test，p＜0.001)。除了miR-449a表达水平，其他临床病理因素如分化程度(log-rank test，p=0.004)、病理学分期(log-rank test，p＜0.001)和淋巴结转移(log-rank test，p＜0.001)都与患者预后相关，而性别、年龄、发病部位、肿物大小、病理分型等因素与NSCLC患者预后未见相关性。　　 为进一步明确临床病理因素与NSCLC患者预后的关系，将上述单因素分析中与NSCLC患者预后有关的四个因素带入多因素COX模型进行分析。结果显示病理分期、淋巴结转移、miR-449a表达高低是影响NSCLC患者预后的独立因素，而分化程度不是影响NSCLC患者预后的独立因素　　 四、miR-449a在非小细胞肺癌细胞系中的表达　　 为了明确miR-449a在肺癌细胞系中的表达情况以及选择合适的细胞进行下一步研究，我们采用RT-qPCR方法检测了肺癌细胞系A549，BE1，LH7，H1299，H157，LK2，LTE，SPC，H460中miR-449a的表达情况，miR-449a肺癌细胞系的表达水平显著低于10例正常组织中miR-449a表达的平均值。值得说明的是miR-449a在同种不同转移潜能亚型的两种细胞中，高转移潜能的BE1细胞系中miR-449a表达水平明显低于低转移潜能的LH7细胞中的表达。我们选择具有miR-449a中等表达强度的A549和H1299细胞为背景细胞进行深入研究。　　 五、转染效率评定　　 为保证细胞学实验的效果，我们分别向A549和H1299细胞系中转染miR-449amimic，mimic control进行转染效率的验证。转染后24小时收集细胞，使用RT-qPCR检测各实验组中miR-449a的含量。在A549和H1299细胞中转染miR-449a mimic组的细胞中miR-449a含量显著高于对照组(PA549＜0.01，PH1299＜0.01)，证明转染有效可以进行后续细胞实验。　　 六、miR-449a对肺癌细胞迁移和侵袭的影响　　 前述结果中miR-449a在NSCLC组织和细胞系中低表达并与淋巴结转移相关，提示miR-449a可能参与调控细胞的迁移和侵袭，我们分别在A549和H1299细胞中调节miR-449a的表达，采用Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力的改变。迁移实验显示，A549细胞中miR-449a mimic组的穿膜细胞数与对照组相比减少了42.9％(p＜0.01)，H1299细胞中miR-449a mimic组的穿膜细胞数与对照组相比减少了36.4％(p＜0.01)，而A549细胞miR-449a inhibitor组中穿膜细胞数与对照组相比增加了62.5％(p＜0.01)，H1299细胞miR-449a inhibitor组中穿膜细胞数与对照组相比增加了48.5％(p＜0.01)。在侵袭实验也得到相似结果。　　 七、miR-449a靶基因的预测　　 为探讨miR-449a在NSCLC中潜在的靶基因，使用三种靶基因预测软件TargetScan5.2(June2011),miRanda(August2010)和Diana-micro T(July2011)预测靶基因。在众多预测的靶基因中，被三种预测软件同时预测到的受体酪氨酸激酶c-Met与miR-449a有两个潜在的结合位点，在多种肿瘤包括NSCLC的发生和进展中起着重要的作用，因此我们推测miR-449a可能通过c-Met影响细胞侵袭和迁移。　　 八、NSCLC组织中miR-449a与c-Met的表达关系　　 为明确NSCLC组织中miR-449a与c-Met的表达关系，我们从84例配对组织中选取27对组织，使用Western blot检测c-Met的表达。27例配对组织中c-Met在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(paired T-test，p＜0.001，t=6.352)，而在这27例组织中miR-449a在癌组织中的表达水平是显著低于癌旁组织的。Spearman相关分析显示27例配对组织中miR-449a与c-Met的表达存在负相关(r=-0.602，p＜0.01)，考虑到miRNA通过与靶基因mRNA互补结合从而抑制靶基因表达的作用方式，c-Met可能为miR-449a的靶基因。　　 九、miR-449a调控靶基因c-Met　　 为证实c-Met是否为miR-449a的靶基因，我们向miR-449a中等表达强度的A549和H1299细胞转染miR-449a mimic，mimic control，miR-449a inhibitor，inhibitor control，转染后48小时收集细胞，使用RT-qPCR检测c-Met mRNA的变化，使用Western blot检测c-Met蛋白水平的变化。在A549细胞中上调miR-449a表达水平，c-Met的mRNA和蛋白都有所减少(mRNA: p＜0.01，蛋白:p＜0.01)，而下调miR-449a表达水平，c-Met的mRNA和蛋白都有所增加(mRNA: p＜0.01，蛋白:p＜0.01)。在H1299细胞系也得到一致结果。　　 为进一步证实c-Met是否为miR-449a直接调控的下游靶基因，我们通过报告基因实验明确miR-449a是否通过c-Met的3UTR的靶位点对其表达进行负向调控。在miR-449a中表达的A549细胞中共转染pcDNA3-EGFP-c-Met质粒和miR-449amimic，mimic control，miR-449a inhibitor, inhibitor control。结果显示共转染pcDNA3-EGFP-c-Met和miR-449a mimic组绿色荧光信号减弱(p=0.019)，共转染pcDNA3-EGFP-c-Met和miR-449a inhibitor组绿色荧光信号增强(p=0.010)。而共转染pcDNA3-EGFP-c-Met质粒和mimic control、inhibitor control与pcDNA3-EGFP-c-Met质粒组比较绿色荧光信号无明显差异。这一结果提示miR-449a通过3UTR区与c-Met直接结合，而对预测的结合位点进行突变后，转染突变质粒的各组绿色荧光信号无明显变化。　　 十、miR-449a通过c-Met调控NSCLC细胞的迁移侵袭　　 miR-449a抑制了NSCLC细胞的迁移侵袭，抑制c-Met的表达。为证实miR-449a是否通过抑制c-Met表达抑制NSCLC细胞的迁移侵袭，我们使用siRNA在A549细胞中干扰了c-Met的表达。 Western blot验证干扰效率(p＜0.01)，且随着c-Met蛋白含量的减少伴随着下游与细胞迁移侵袭密切相关的MMP2(p＜0.01)和MMP9(p＜0.01)含量的减少。结果显示miR-449a inhibitor与c-Met siRNA共转染组中miR-449a对细胞迁移侵袭的影响被阻断了，并且伴随着下游MMP2和MMP9的变化。由此可见，miR-449a可能通过c-Met调节细胞的迁移侵袭，与肿瘤转移密切相关。　　 结论：　　 1、miR-449a在非小细胞肺癌中低表达，与病理分期、淋巴结转移和预后生存率呈负相关。　　 2、miR-449a通过直接抑制靶基因c-Met抑制了NSCLC的迁移侵袭能力。