马立克氏病病毒CVI988株pp24基因的克隆,表达及其部分生物学活性的研究

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pp24蛋白是马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)的一个特异性蛋白,由pp24基因编码。该蛋白在天然状况下可能与MDV的另一个特异性蛋白-pp38以异二聚体的形式结合在一起,共同在MDV的致肿瘤中发挥作用。 根据马立克氏病病毒国际参考强毒GA株pp24基因序列,设计和合成了一对引物,其两端分别含Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点。以CVI988株基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增其pp24基因阅读框(ORF)。PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳表明,所获得的PCR产物的分子量大小约为467bp,该DNA条带大小与理论设计的核酸片段大小相符。PCR产物经纯化、酶切后,按正确的阅读框架定向克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化进大肠杆菌BL21中,在1.0mM IPTG和37℃条件下诱导,GST-pp24基因获得了表达。诱导菌体的裂解物经12%的SDS聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot试验验证,得到大小为43KD的融合蛋白,与预期大小一致。 将表达产物从SDS-PAGE凝胶中切出回收,蛋白条带冻干并碾成粉末,粉末与PBS适量混合后,腹腔注射8周龄健康ICR小鼠,20μg/只,每周免疫一次,第五次免疫后10天眼球采血,析出血清,所得的抗血清与MDV 814株和RB1B株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果呈阳性反应。表明大肠杆菌中表达的pp24融合蛋白保留有特异的抗原性。 本研究制备的MDV pp24融合蛋白,为进一步制备抗pp24蛋白的单克隆抗体提供了前提条件。为进一步研究pp24基因的生物学活性提供了一些可借鉴的方法。
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